Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

張?jiān)频?，?源，王 軍，文 明， 周碧君，岳 筠，李 濤，程振濤

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550008)

Ⅰ群禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4 , FAdV-4)是雞心包積液-肝炎綜合癥(Hydropericardiumsyndrome-inclusion body hepatitis, HHS)的病原[1]。1987年在巴基斯坦卡拉奇的安卡拉地區(qū)首先被發(fā)現(xiàn)，故也稱(chēng)為安卡拉病(Angara disease)[2]，隨后在美洲的墨西哥、秘魯、智利，亞洲的印度、韓國(guó)、日本等地都發(fā)現(xiàn)該病。自2015年6月起，中國(guó)很多城市都有HHS相關(guān)病例的報(bào)道，病雞臨床癥狀主要表現(xiàn)為心包積液、肝臟腫大發(fā)炎。病毒主要感染3～6周齡的肉雞，也有蛋雞感染的報(bào)道[1-4]。該病發(fā)病急，擴(kuò)散能力強(qiáng)，可水平傳播和垂直傳播，病程 8～ 15 d，死亡率 30%～80% 不等[4]。目前，F(xiàn)AdV-4在雞上的感染機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道，禽腺病毒病的種類(lèi)多、血清型復(fù)雜，F(xiàn)AdV-4感染容易與其他血清型感染相混淆，且FAdV-4與傳染性貧血病毒(CIAV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)有協(xié)同作用[4-5]，給該病的診斷和防控增加了難度[3]。因此，建立一種快速、特異、敏感的方法尤為重要。

目前對(duì)FAdV-4檢測(cè)的方法仍較為傳統(tǒng)，主要局限于病毒的分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、中和試驗(yàn)等，這些方法存在特異性不高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性等缺點(diǎn)[4]。TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR因其敏感性好和特異性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于病原核酸檢測(cè)，而且TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比普通PCR和染料法熒光定量PCR更特異、敏感。針對(duì)FAdV-4臨床流行趨勢(shì)日益嚴(yán)重現(xiàn)狀，本研究針對(duì)FAdV-4Hexon基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立快速檢測(cè)FAdV-4的TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，旨在為FAdV-4的檢測(cè)、HHS 的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 毒 株

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、雞痘病毒、傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)和雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBD)購(gòu)自揚(yáng)州威克生物科技有限公司；減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)和H9亞型禽流感病毒(H9 subtype avian influenza virus, AIV)由貴州福斯特生物科技有限公司提供；以上毒株均為疫苗毒株。質(zhì)粒pMD18-T/FAdV-4Hexon的陽(yáng)性重組菌由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試 劑

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方 法

1.3.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的FAdV-4(GenBank登錄號(hào)：GU188428.1)Hexon基因序列，與禽腺病毒其他血清型序列比對(duì)后，根據(jù)引物和探針的設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為77 bp的特異性引物，F(xiàn)AdV-4-F：5′-TTCGACATCAAGGGAATCCATGA-3′ ，F(xiàn)AdV-4-R：5′-GG- AGCCAGCGGGTTGTAA-3′和1條TaqMan探針FAdV-4-T ：5′-CCGTCCTTCAAGCCCTA- CTGCGG-3′ ，探針5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM， 3′端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)和BHQ，上述引物和探針由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備 將含陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-T/FAdV-4Hexon的陽(yáng)性重組菌接種于含Amp(終質(zhì)量濃度5 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒質(zhì)量濃度，樣品-20 ℃保存，備用。

1.3.3 反應(yīng)體系的建立與反應(yīng)條件優(yōu)化 以提取的質(zhì)粒DNA為模板，建立20 μL TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，分別對(duì)退火溫度、探針和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，方案如下：根據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)退火溫度梯度為：55 、57、59和61 ℃。引物濃度為7.5、10和12.5 pmol/L。探針濃度為8、10和12 pmol/L。20 μL反應(yīng)體系：Premix ExTaq(Probe qPCR) (2×) 10 μL，DNA模板2 μL， 引物和探針按照設(shè)計(jì)方案配比加入，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，退火20 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值篩選最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 重組質(zhì)粒原液拷貝數(shù)為2.03×1010copies/μL，按10倍梯度稀釋?zhuān)?.03×108～2.03×104copies/μL濃度梯度質(zhì)粒作為模板，按照上述PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。 以質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值lg(x)為x軸，以CT值為y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法性能評(píng)價(jià)

1.4.1 敏感性檢測(cè) 以2.03×108～2.03×100copies/μL濃度梯度質(zhì)粒作為模板，檢測(cè)TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性。根據(jù)CT值與模板濃度線性相關(guān)關(guān)系判定結(jié)果，當(dāng)模板濃度低于熒光定量的檢出下限時(shí)判定為陰性樣本。此時(shí)CT值大于35[5-6]。

采用本研究設(shè)計(jì)的引物(表1)和建立的反應(yīng)條件對(duì)系列濃度梯度進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，以呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為檢測(cè)靈敏度。PCR反應(yīng)體系：模板2 μL，PCR Mix 12.5 μL，引物FAdV-4-F/R各1 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4.2 重復(fù)性分析 組間重復(fù)：以5份不同稀釋梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(2.03×108～2.03×104copies/μL)為模板，用所建立的方法進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。組內(nèi)重復(fù)：取同一稀釋梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在上述建立好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)重復(fù)。根據(jù)變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)差(SD)/平均數(shù)(X)分別計(jì)算變異系數(shù)，分析組間和組內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.4.3 特異性檢測(cè) 分別提取雞痘病毒和減蛋綜合征病毒DNA為模板，同時(shí)參照病毒基因組RNA提取方法提取新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒和H9亞型禽流感病毒的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T/FAdV-4Hexon為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水為陰性對(duì)照，進(jìn)行TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)方法的特異性。

1.4.4 臨床應(yīng)用性評(píng)價(jià) 為評(píng)估所建立方法的臨床應(yīng)用性，對(duì)采自貴州省3個(gè)地區(qū)的10份疑似病料按上述建立的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行檢測(cè)，并與普通PCR方法和病毒分離培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估建立方法的臨床可應(yīng)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系建立

由圖1可知，基于設(shè)計(jì)的引物和TaqMan探針?biāo)⒌膶?shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，能有效擴(kuò)增目的基因并形成規(guī)則的擴(kuò)增曲線。

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

對(duì)初步建立的 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的退火溫度、引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，最佳退火溫度為59 ℃(圖2和表2)，最優(yōu)引物濃度為10 pmol/L，探針濃度為8 pmol/L(表3和圖3)。

圖1 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Fluorescence amplification curves of real time fluorescent quantitative PCR reaction

圖2 不同退火溫度擴(kuò)增曲線Fig.2 Fluorescence amplification curves of different annealing temperatures

表2 退火溫度優(yōu)化Table 2 Optimization of annealing temperature

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以2.03×108～2.03×104copies/μL濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T/FAdV-4Hexon為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線(圖4-A)、CT值與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-B)。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度與CT值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為1.000，回歸曲線斜率為-3.36，截距為46.28，擴(kuò)增效率為98.44% 。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-3.36× logx+46.28，其中y為CT值，x為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

表3 引物濃度和探針濃度優(yōu)化Table 3 Calibrated concentration of primer and probe

A.不同引物濃度擴(kuò)增曲線 Fluorescence amplification curves of different prime concentrations;B.不同探針濃度擴(kuò)增曲線 Fluorescence amplification curves of different probe concentrations

圖3 不同引物和探針濃度擴(kuò)增曲線
Fig.3 Fluorescence amplification curves of different primer and probe concentrations

圖4 FAdV-4 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線學(xué)曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.4 Dynamic curve(A) and standard curve(B) of FAdV-4 using TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR assay

2.4 FAdV-4 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法性能評(píng)價(jià)

2.4.1 特異性檢測(cè) 普通PCR結(jié)果顯示，僅陽(yáng)性對(duì)照樣本出現(xiàn)約77 bp的擴(kuò)增條帶，其他6種供試毒株均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖5)，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物特異性良好。TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，僅 pMD18-T/FAdV-4Hexon陽(yáng)性樣本有明顯的熒光擴(kuò)增信號(hào)(CT值為13.63)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；其他供試毒株基因組DNA有微弱的擴(kuò)增信號(hào)(CT值均大于 35)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明引物(FAdV-4-F/R)有良好的特異性(圖6)。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL50 DNA marker; 1.FAdV-4;2～7.NDV,APV,IBV,IBDV,EDVS,AIVH9

圖5 Ⅰ群禽腺病毒血清4型普通PCR特異性檢測(cè)
Fig.5 Specific detection ofFAdV-4 using traditional PCR assay

1.FAdV-4 2～7.NDV,APV,IBV,IBDV,EDVS,AIVH9;8.陰性對(duì)照 Negative control

2.4.2 敏感性檢測(cè) 以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T/FAdV-4Hexon(2.03×108～2.03×100copies/μL)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)方法的敏感性。結(jié)果顯示，當(dāng)陽(yáng)性質(zhì)粒模板拷貝數(shù)為2.03×100copies/μL時(shí)仍能出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，CT=33.6，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明最低檢出濃度為2.03×100copies/μL(圖7)。

1～9.10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(2.03×108～2.03×100copies/μL) Refer to 2.03×108-2.03×100copies/μL from ten-fold dilutions of standard plasmid；10.陰性對(duì)照 Negative control

圖7 FAdV-4 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果
Fig.7 Sensitive detection of FAdV-4 using TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR assay

應(yīng)用FAdV-4-F 和FAdV-4-R 引物經(jīng)常規(guī)PCR檢測(cè)，質(zhì)粒濃度小于2.03× 105copies/μL以后無(wú)擴(kuò)增條帶(圖8 )，表明常規(guī)PCR方法的靈敏度為2.03× 105copies/μL。

2.4.3 重復(fù)性檢測(cè)分析 以不同稀釋梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(2.03×108～2.03×100copies/μL)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果顯示，組內(nèi)CT值的變異系數(shù)為0.06%～0.78%，組間CT值的變異系數(shù)為0.02%～0.86%，均小于1% (表4)。

2.4.4 臨床樣本的檢測(cè) 應(yīng)用建立的FAdV-4 TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，除陽(yáng)性對(duì)照外，有8份臨床樣本為陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為80%(8/10)(圖9)，

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL50 DNA marker；1～9.10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒2.03×108～2.03×100copies/μL Refer to 2.03×108-2.03×100copies/μL from ten-feod dilutions of standard plasmid

圖8 群禽腺病毒血清4型普通PCR靈敏性檢測(cè)結(jié)果
Fig.8 Sensitive detection of FAdV-4using traditional PCR assay

而普通PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性率為30%(3/10)(圖10)，其中樣本1、2、5、6、7在普通PCR中未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。說(shuō)明，建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法更加靈敏、高效，可更好地應(yīng)用于FAdV-4 的檢測(cè)，為其防控提供更準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

表4 Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Repeatability results of TaqMan real-time PCR assay for detection of FAdV-4

+.陽(yáng)性對(duì)照 Positive control；1～10.樣本 Specimens ；-.陰性對(duì)照 Negative control

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL50 DNA Marker ;+.陽(yáng)性對(duì)照 Positive control；1～10.樣本 Specimens ；-.陰性對(duì)照 Negative control

圖10 臨床樣本的FAdV-4 PCR檢測(cè)結(jié)果
Fig.10 Detecting results of clinical specimensusing FAdV-4 PCR assay

3 討 論

雞心包積液-肝炎綜合征最早于1987年在巴基斯坦卡拉奇的安卡拉地區(qū)暴發(fā)流行，因此也叫“安卡拉”病，世界上已有40多個(gè)國(guó)家報(bào)道有雞心包積液-肝炎綜合征流行，但分離或檢測(cè)到FAdV-4的只有19個(gè)國(guó)家[7]，2015年6月以來(lái)，中國(guó)很多省份報(bào)道有該病的爆發(fā)流行，主要集中在河南、山東、黑龍江、河北、安微和遼寧等地區(qū)的雞群。在這之前，中國(guó)尚未出現(xiàn)該病的大面積暴發(fā)，近年來(lái)，該病的發(fā)病范圍還在不斷擴(kuò)大，給中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8]。目前針對(duì)該病的確診方法有限，臨床上易與雞包涵體肝炎病混淆，感染后同時(shí)引起如禽流感、禽白血病、傳染性法氏囊、大腸桿菌病等繼發(fā)感染[9-10]，這些因素給該病的臨床診斷帶來(lái)一定困難，單憑簡(jiǎn)單的病變觀察和臨床剖檢手段無(wú)法確診。實(shí)驗(yàn)室主要采用中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)法及免疫熒光技術(shù)等方法對(duì)FAdV-4進(jìn)行檢測(cè)，這些檢測(cè)方法具有較好的特異性，但存在敏感性和檢測(cè)效率低等缺點(diǎn)[11]。PCR方法廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病病原的臨床快速檢測(cè)，大大提高對(duì)疫病病原的檢測(cè)效率。六鄰體(Hexon)基因編碼的蛋白是FAdV-4的主要表面抗原蛋白，含有型與型之間的特異性抗原表位和中和性抗原表位，其中型間特異性表位作為禽腺病毒特征性標(biāo)志和抗原靶位用于腺病毒感染的快速診斷具有重要意義[12]。對(duì)Ⅰ群禽腺病毒六鄰體氨基酸序列進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，Hexon基因保守區(qū)的GC含量較高，致使設(shè)計(jì)的引物易出現(xiàn)引物二聚體，影響普通PCR或SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測(cè)效果。文艷玲等[13]建立Ⅰ群禽腺病毒SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測(cè)方法，表明該方法中熒光染料能與任一雙鏈DNA結(jié)合，也能與非特異的雙鏈DNA(如引物二聚體)結(jié)合，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，給檢測(cè)帶來(lái)困難。TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以標(biāo)記特異性熒光探針為特點(diǎn)，兼?zhèn)浜怂岣咝U(kuò)增、光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，具有極高的特異性，并且不易造成交叉污染[14]。 唐熠等[15]認(rèn)為傳統(tǒng)PCR技術(shù)的靈敏度變幅一般為103～104copies/μL，而本研究中普通PCR檢測(cè)靈敏度只有2.03×105copies/μL，這與TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的檢測(cè)靈敏度2.03×101copies/μL存在較大差距。TaqMan探針?lè)ê蜔晒馊玖戏ǘ縋CR存在明顯差異，不同的目的基因擴(kuò)增區(qū)域擁有特定的探針，TaqMan探針不會(huì)與體系中的所有DNA雙鏈結(jié)合，因此大大減少引物二聚體和非特異性擴(kuò)增等熒光信號(hào)出現(xiàn)[16-17]，且反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線計(jì)算出準(zhǔn)確的CT值，可根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中病原種類(lèi)和含量，是真正意義上的DNA定量[18]。本研究根據(jù)Hexon基因保守區(qū)GC含量較高的特征，設(shè)計(jì)TaqMan探針，建立探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR方法，大大提高FAdV-4病原核酸的檢測(cè)準(zhǔn)確度和效率。

TaqMan探針技術(shù)對(duì)引物和探針的設(shè)計(jì)要求極其嚴(yán)格，設(shè)計(jì)合成的探針中即使只有一個(gè)堿基發(fā)生突變也有可能阻斷熒光信號(hào)激發(fā)[19]，同時(shí)，建立此方法時(shí)需要進(jìn)行特異性、敏感性和臨床應(yīng)用性檢測(cè)。 本研究在建立檢測(cè)FAdV-4病原的方法時(shí)，選取易被Ⅰ群禽腺病毒血清4型混合感染的新城疫病毒(NDV)、雞痘病毒、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBD)、減蛋綜合征病毒(EDSV)和H9亞型禽流感病毒(AIV)及空白對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)，評(píng)估針對(duì)其他病毒是否產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增[20-21]。結(jié)果證明TaqMan探針?lè)ㄓ泻芨叩奶禺愋?，與其他檢測(cè)對(duì)象均無(wú)交叉反應(yīng)。本研究對(duì)敏感性評(píng)價(jià)時(shí)，在進(jìn)行引物序列和探針序列分析的基礎(chǔ)上，有效評(píng)估所建立方法的敏感性，且敏感性達(dá)到2.03×100copies/μL，比文艷玲等[13]建立的SYBR GreenⅠ熒光素法1×102copies/μL高 100倍。TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR另一大特點(diǎn)是對(duì)樣本中目的基因檢測(cè)的絕對(duì)定量，這廣泛應(yīng)用于病原組織嗜性、基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)等分析[22]。近年來(lái)，TaqMan探針?lè)ㄔ卺t(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)科學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，由于其特異、靈敏性高等特點(diǎn)，在核酸分子檢測(cè)技術(shù)中占有重要地位和強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿23-25]。本研究基于FAdV-4Hexon基因所建立的TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR具有良好的特異性、敏感性、可重復(fù)性和臨床應(yīng)用性，可用于臨床病例的快速診斷、病原組織嗜性等研究工作，為貴州省日益嚴(yán)重的雞心包積液-肝炎綜合征疫情防控提供關(guān)鍵技術(shù)，為FAdV-4貴州流行株的致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。