豬丹毒絲菌滅活疫苗制備及其對小鼠免疫效力的評價

陳 章，劉曉露，姚焱彬，吳瓊娟，孫 裴，魏建忠，李東風，李 郁

(1.安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230036；2.安徽省獸藥飼料監察所，合肥 230001)

豬丹毒(Swine erysipelas)是由豬丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一種急性、熱性人畜共患傳染病。早在20世紀80年代，該病就與豬瘟、豬肺疫并稱為中國養豬業的三大傳染病，造成巨大的經濟損失。隨著規模化養豬的發展、抗生素的大量使用以及疫苗的免疫預防，其危害減輕，防控被忽視。然而，近年來，在中國廣西、廣東、四川、福建、江西、安徽、吉林、黑龍江等多地均有豬丹毒的發生，且呈逐漸嚴重之勢[1]。不僅如此，臨床上多見豬丹毒絲菌與鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬圓環病毒2型以及豬藍耳病病毒等混合感染或繼發感染，致使病情復雜化，增加發病率和病死率[2]。

目前，防控豬丹毒的方式主要有抗生素治療和疫苗免疫。抗生素雖然臨床使用效果較好，但隨著養殖業中的過度使用和濫用，引起豬丹毒絲菌耐藥性的產生[3]。在無抗養殖逐漸成為共識的今天，疫苗免疫仍然是預防豬丹毒最有效的辦法。豬丹毒商品化疫苗主要包括豬丹毒滅活疫苗(以血清型2型為主)和弱毒疫苗(以血清型1a型或2型為主)。弱毒苗有毒力返強、加重豬群關節損傷等風險，效果常受到母源抗體和抗生素的影響。羅雪剛等[4]發現豬丹毒弱毒疫苗對現有的流行菌株缺乏較好的免疫保護作用。就安全性而言，滅活疫苗明顯優于弱毒疫苗，且相對穩定、可制備多聯苗，但存在免疫效力不足、免疫維持時間較短等問題。此外，滅活疫苗質量常受到菌種、抗原含量、滅活劑及佐劑等因素影響[5-6]。

本研究將3株受試菌株(AEr21、AEr31和AEr32)[7]在改良豬丹毒疫苗培養基中培養至穩定期，經終質量濃度為2mg/L的甲醛滅活11h后，用礦物油佐劑ISA201VG制備成滅活疫苗，與商品化疫苗分別免疫小鼠。通過檢測免疫小鼠血清IgG抗體、細胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)、CD4+/CD3+和CD8+/CD3+T細胞亞群以及疫苗免疫后對攻毒小鼠的免疫保護率，確定受試菌株制備的滅活疫苗的免疫效果，從而為提高豬丹毒滅活疫苗的免疫效力、有效防治豬丹毒提供技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 受試菌株：從臨床病豬分離鑒定的42株豬丹毒絲菌，血清型均為1a型。首先通過小鼠100% 致死性試驗(攻毒劑量為100 cfu/mL)篩選出4株強毒菌株；經致病力試驗、抗原性試驗和穩定性試驗，進一步篩選出3株用于制備疫苗的菌株，分別編號為AEr21、AEr31和AEr32(表1)。由安徽農業大學動物傳染病研究室保存和提供。

攻毒菌株：編號為LA 20130329，血清型為1a型，分離自臨床急性敗血型病豬，對小鼠的LD50為845 cfu/mL，由安徽農業大學動物傳染病研究室保存和提供。依據豬丹毒絲菌標準菌株對小鼠的LD50為50 cfu/mL，將LA 20130329確定為攻毒菌株，攻毒劑量設定為100LD50。

表1 3株受試菌株的背景資料Table 1 Background information of 3 strains for producing seedlings

1.1.2 商品化疫苗 豬丹毒弱毒疫苗(GC42株)購自廣西麗原生物股份有限公司；豬丹毒滅活疫苗購自浙江詩華諾倍威生物技術有限公司。

1.1.3 試劑 36 g/L酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯培養基 (TSB-YE) 、 48 g/L 酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂培養基 (TSA-YE) 購自紹興天恒生物科技公司；豬丹毒(疫苗)培養基購自青島高科園海博生物技術公司；MONTANIDE TM ISA 201 VG礦物油佐劑、葡萄糖購自西隴化工公司；吐溫80、氫氧化鈉、氫氧化鋁均購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醛購自上海蘇懿化學試劑公司；三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 購自博奧拓達有限公司；細胞因子ELISA檢測試劑盒(IL-4、IL-10、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)購自美國 RB 公司；CD4+/CD8+流式細胞抗體試劑盒購自美國BD公司。

1.1.4 試驗動物 體質量為18～22 g SPF級雌性昆明小鼠購自安徽醫科大學試驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 滅活疫苗的制備 3株受試菌株(AEr21、AEr31、AEr32)在改良豬丹毒絲菌培養基中培養至穩定期后，經終質量濃度為2 mg/L甲醛37 ℃振蕩滅活(150 r/min)11 h，與礦物油佐劑 ISA 201 VG制備成滅活疫苗。經無菌性檢驗和安全性檢驗合格后，與商品化疫苗以相同免疫程序免疫小鼠。

1.2.2 免疫小鼠分組 將140只小鼠隨機分成6組，A、B、C、D、E組，每組20只，F組40只，包括陰性對照組和攻毒對照組各20只，具體分組見表2。A、B、C組分別為AEr21全菌體滅活疫苗、AEr31全菌體滅活疫苗和 AEr32全菌體滅活疫苗；D、E組分別為商品化豬丹毒弱毒疫苗和商品化豬丹毒滅活疫苗；F組為生理鹽水對照組。免疫途徑均為皮下多點注射，劑量為0.2 mL(濃度為1.5×1010cfu/mL)。一免14 d后采用同樣方式和同等劑量進行第 2 次免疫。

1.2.3 血清IgG抗體檢測 采集一免及二免 14 d后各組小鼠的血清，每組5只。參照文獻[8]，用純化的重組SpaA[9]包被酶標板的ELISA方法進行抗體檢測。同時用全菌體超聲裂解物包被酶標板的ELISA方法進行抗體檢測，用包被液將全菌體超聲裂解物稀釋成10 μg/mL，包被酶標板4 ℃過夜。洗板 3 次后，50 g/L 的脫脂奶粉37 ℃封閉 2 h。洗板 3 次后，血清從1∶25 ～ 1∶819 200(2倍梯度進行)加入板孔，37 ℃作用1 h。洗板 3 次后加入稀釋的羊抗鼠 HRP-IgG，反應 1 h。洗板 3 次后加入TMB顯色液，室溫條件下避光靜置 10 min后加入終止液，輕輕振蕩后放于酶標儀中測定 OD450。根據待檢血清OD(P)/陰性血清OD(N)≥ 2.1的界限判斷為陽性，測定其抗體效價。

1.2.4 外周血CD4+、CD8+T 細胞亞群百分比測定 利用小鼠眼球摘除法，分別取一免及二免14 d后的小鼠外周血，每組5只。取100 μL的外周血放入2 mL的離心管中，再加入1.8 mL的細胞裂解液，利用掌上離心機1 500 r/min渦旋8～10 s，生物安全柜中靜置30 min。然后1 500 r/min離心5 min，輕輕拿起離心管，棄去上清液。分別在樣品管中加入2 mL滅菌PBS緩沖液(pH為7.4)，掌上離心機1 500 r/min 徹底渦旋8～10 s。建立陰性對照組和待檢測組。陰性對照共 4 組，第 1 組為不加染料組，另外3組分別加入CD3+、CD4+和 CD8+單一熒光染料；待檢測組加入CD3+、CD4+和CD8+3種熒光染料，避光靜置30 min。用1 mL的 PBS(pH為7.2)吹洗樣品，2 000 r/min 離心5 min后，加入滅菌的PBS調節細胞至105mL-1，轉移至流式細胞管中，利用流式細胞儀檢測并分析數據。

1.2.5 血清細胞因子檢測 一免及二免14 d后，采集小鼠血清，每組5只。按照細胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)檢測試劑盒說明書進行各組小鼠血清中細胞因子含量的檢測。

1.2.6 免疫保護率測定 二免14 d后，將各組剩余的10只小鼠平均分成2組，一組采用腹腔注射方式攻毒小鼠，另一組采用灌胃方式攻毒小鼠。攻毒菌株為 LA 20130329，劑量為100 LD50，陰性對照組注射等量PBS。計算各組的免疫保護率，收集各組小鼠的內臟(肝臟、脾臟、肺臟和腎臟)，置于福爾馬林(φ=10%的甲醛)中固定并保存。

1.2.7 病理組織切片制作 所有固定的小鼠內臟(肺臟、肝臟、脾臟和腎臟)經常規石蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅染色等步驟，制備成病理組織切片，觀察各臟器的病理組織變化。

1.2.8 數據處理 所有數據的繪圖采用軟件Excel 2007和Graphpad 6.0制作，差異性統計采用 SPSS 20.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)LSD分析處理。

2 結果與分析

2.1 血清IgG抗體檢測

采集一免及二免14 d后的各組小鼠血清，應用ELISA方法檢測小鼠血清中IgG抗體。用重組SpaA作為包被抗原，A、B、C、D、E組的二免抗體效價分別為1∶3 200、1∶6 400、1∶1 600、 1∶6 400、1∶3 200，B組和D組免疫小鼠產生的IgG抗體效價最高；用全菌體超聲破碎裂解物作為包被抗原，A、B、C、D、E組的二免抗體效價分別為 1∶3 200、1∶6 400、1∶3 200、1∶25 600和 1∶6 400，D組免疫小鼠產生的IgG抗體效價最高(表3)。

2.2 外周血CD4+、CD8+ T細胞亞群百分比檢測結果

2.2.1 外周血CD4+細胞亞群在總T細胞中所占百分比 由圖1可知，各滅活疫苗免疫組CD4+/CD3+T細胞比率與對照組相比均顯著增加(P<0.05)。在A、B、C 3 組中，B組 CD4+/CD3+T細胞的比率最高，組間差異不顯著(P>0.05)。與商品化疫苗組相比，二免后D組 CD4+/CD3+T細胞比率最高，且與所有的滅活疫苗組差異顯著(P<0.05)。結果顯示，二免后，D組小鼠產生的 CD4+/CD3+T細胞比率高于其他疫苗組。

相同免疫后時間內不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Different lowercase letters in the same number of weeks after immunization indicate significant difference(P<0.05),the same below

圖1 小鼠外周血中CD4+細胞亞群在總T細胞中所占百分比
Fig.1 Percentage of CD4+Tsubsets in T cellsafter immunization of mice

2.2.2 外周血 CD8+細胞亞群在總T細胞中所占百分比 由圖2可知，在A、B、C 3 組中，B組CD8+/CD3+T細胞比率最高，但差異不顯著(P>0.05)。與商品化疫苗組相比，第2次免疫后D組的CD8+/CD3+T細胞比率最高，與C組差異顯著(P<0.05)，但與其他疫苗組差異不顯著(P>0.05)。結果顯示，二免后，C組小鼠產生的CD8+/CD3+T細胞比率低于其他疫 苗組。

2.3 血清細胞因子檢測結果

由圖3可知，各滅活疫苗組的小鼠血清中細胞因子質量濃度與對照組相比均有所升高，且差異顯著(P<0.05)。在A、B、C 3 組中，B組細胞因子質量濃度較高，但組間差異不顯著(P> 0.05)。二免后，IL-4和IL-10的質量濃度，D組與A、C、E組差異顯著(P<0.05)；TNF-β的質量濃度，D組與C組差異顯著(P<0.05)，其他各組間差異均不顯著(P>0.05)。結果顯示，各疫苗組均可誘導小鼠產生較高水平的細胞因子，其中D組誘導小鼠產生的細胞因子質量濃度最高。

圖2 小鼠外周血中 CD8+細胞亞群 在總T細胞中所占百分比Fig.2 Percentage of CD8+ Tsubsets in T cells after immunization of mice

2.4 免疫保護率測定結果

二免14 d后，采用腹腔注射和灌胃2種方式對免疫后的小鼠進行攻毒，結果見表4。陰性對照組(F組)所有小鼠全部死亡，B、D、E 3 組均具有良好的免疫保護水平，保護率為100%。

2.5 各臟器組織病理組織學觀察

2.5.1 肺臟 由圖 4 可以看出，A1、A3、A4、A6、A7和A8組均無明顯病理變化；A2組肺泡壁增寬，嚴重充血；A5組大量肺泡壁斷裂，充血嚴重；A9組大量肺泡壁斷裂，肺泡壁增寬且充血 嚴重。

2.5.2 肝臟 由圖 5 可以看出，B1組少量肝細胞發生變性、壞死，出現少量的肝吞噬細胞；B2組肝細胞發生空泡變性，部分細胞核消失，大量炎性細胞浸潤；B3組少量肝細胞胞質濃縮；B4組大量肝細胞胞質濃縮，部分細胞核淡染、消失；B5組肝細胞發生壞死，大量炎性細胞發生浸潤；B6組大量肝細胞胞質濃縮，部分細胞核淡染、消失，出現少量的肝吞噬細胞；B7組少量肝細胞胞質濃縮；B8組無明顯病理變化；B9組局部肝細胞壞死，大量炎性細胞浸潤。

2.5.3 脾臟 由圖 6 可以看出，C1組紅髓與白髓間隙不明顯，大量炎性細胞浸潤；C2組充血嚴重，脾小體腫大，少量炎性細胞浸潤；C3組大量炎性細胞浸潤；C4 組脾小體腫大，充血嚴重；C5 組脾小體腫大，紅髓與白髓間隙不明顯，充血嚴重；C6組少量充血，大量炎性細胞浸潤；C7組充血嚴重，脾小體腫大；C8組無明顯病理變化；C9組充血嚴重，中央動脈周圍細胞疏松，脾小體腫大。

圖3 小鼠血清中細胞因子檢測結果Fig.3 Determination of cytokine levels after immunization of mice

組別Group感染數Number of infection感染途徑Routeof infection接種劑量Inoculatingdose死亡數Number of death死亡率/%Rate of death保護率/%Rate of protectionA5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50120805灌胃 Gavage100LD5012080B5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100C 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50240605灌胃 Gavage100LD5000100D 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100E5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100攻毒對照組 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD5051000Challenge control5灌胃 Gavage100LD5051000陰性對照組5腹腔注射 Intraperitoneal injection等量 PBS Equal PBS00100Negative control5灌胃 Gavage等量 PBS Equal PBS00100

2.5.4 腎臟 由圖7可以看出，D1組腎小管上皮細胞腫脹；D2組腎臟充血嚴重，腎小囊上皮細胞腫脹；D3組腎小管上皮細胞腫脹；D4組腎小球上皮細胞腫脹、充血；D5組腎臟充血嚴重，腎小囊上皮細胞腫脹、充血；D6組腎小球上皮細胞腫脹、充血；D7組腎小管上皮細胞腫脹；D8組無明顯病理變化；D9組腎臟充血嚴重，腎小球上皮細胞腫脹、充血，腎小囊上皮細胞腫脹。

A1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A；A2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；A3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；A4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C；A5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；A6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；A7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；A8.陰性對照組 Negative control group；A9.攻毒對照組 Drug attacking control group

圖4 各組小鼠肺臟病理學組織觀察(HE 染色， 200×)
Fig.4 Histopathological observation of lung in each group of mice(HE staining，200 ×)

B1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A ；B2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；B3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；B4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C ；B5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；B6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；B7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；B8.陰性對照組 Negative control group；B9.攻毒對照組 Drug attacking control group

圖5 各組小鼠肝臟病理學組織觀察(HE 染色， 200×)
Fig.5 Histopathological observation of liver in each group of mice(HE staining，200×)

C1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A；C2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；C3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；C4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C；C5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；C6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；C7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；C8.陰性對照組 Negative control group；C9.攻毒對照組 Drug attacking control group

圖6 各組小鼠脾臟病理學組織觀察(HE 染色，200×)
Fig.6 Histopathological observation of spleen in each group of mice(HE staining，200×)

D1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A；D2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；D3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；D4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C；D5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；D6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；D7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；D8.陰性對照組 Negative control group；D9.攻毒對照組 Drug attacking control group

圖7 各組小鼠腎臟病理學組織觀察(HE 染色， 200×)
Fig.7 Histopathological observation of kidney in each group of mice(HE staining，200×)

3 討 論

豬丹毒作為一種老病新發的疾病，近年來在中國的廣州、云南、江蘇、安徽等地均有報道，在其他國家諸如美國、日本、加拿大等豬丹毒的檢出率也明顯增多[10]。從目前的感染情況來看，該病已從單純感染逐漸演變為復雜的混合感染、繼發感染，導致臨床上豬群的發病率和死亡率明顯升高[11]。急性豬丹毒具有病程短、病死率高等特點，而抗生素的應用存在藥物殘留、細菌耐藥性等弊端，使用率正逐年減少[12-13]。目前，疫苗免疫仍然是防控豬丹毒的首選。

疫苗能否刺激機體產生特異性的體液免疫反應，是用來評價疫苗免疫效果的重要指標。IgG是介導體液免疫的主要抗體，在參與抗感染的過程中扮演重要角色[14]。良好的佐劑不僅有助于增強機體對抗原的免疫應答能力，而且能夠使體內產生的IgM完全轉換為IgG[15]。包被抗原的質量對ELISA檢測抗體水平的靈敏度和特異性具有決定性影響。在豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫刺激的抗體效價比較中，本研究采用全菌體超聲破碎裂解物和重組SpaA分別作為ELISA的包被抗原，在用重組SpaA作為包被抗原建立的ELISA檢測方法中，AEr31全菌體滅活疫苗組和商品化弱毒滅活疫苗組的抗體效價最高，均為 1∶6 400；而在用全菌體超聲破碎裂解物作為包被抗原建立的ELISA檢測方法中，商品化弱毒疫苗免疫組的抗體效價達到1∶25 600。原因可能有：(1)弱毒疫苗與滅活疫苗相比，可在體內繁殖，因而可持續刺激機體產生較高水平的抗體；(2)SpaA蛋白是豬丹毒絲菌的主要保護性蛋白，說明2種疫苗在誘導機體產生主要保護性抗體效果相同，滅活疫苗在滅活過程中可能會使一些非保護性蛋白失去活性，因而在針對全菌體超聲破碎裂解物作為包被抗原建立的ELISA檢測方法中，抗體效價低于弱毒疫苗刺激產生的抗體效價。

細胞因子是一類具有多功能的蛋白分子，在參與并介導機體免疫反應過程中發揮著重要的作用[16]。Th細胞是機體免疫應答的啟動細胞，它能夠促進T細胞和B細胞的免疫應答。Th1細胞(輔助性T細胞1)主要分泌TNF-β、IFN-γ、IL-2等，介導著細胞免疫和炎癥反應；Th2細胞(輔助性T細胞2)主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等，參與體液免疫。MCP-1作用于Th1和Th2的細胞分化。本研究結果表明，在豬丹毒絲菌滅活疫苗的免疫效果比較中，商品化豬丹毒弱毒疫苗組免疫小鼠后產生的Th1細胞明顯優于滅活疫苗組(P>0.05)。T細胞是機體免疫應答的核心細胞，通常檢測T細胞相應的CD分子作為細胞亞群的測定指標，一般CD3+作為T細胞的總數，CD4+代表Th細胞，CD8+代表Tc細胞(殺傷性T細胞)[15]。Tc細胞可在Th細胞的輔助下，發揮特異性殺傷或溶解靶細胞的功能，采用流式細胞術的方法檢測T細胞可以了解各免疫組誘導小鼠產生的細胞免疫。商品化豬丹毒弱毒疫苗組誘導小鼠產生的CD4+/CD3+T細胞比率明顯高于滅活疫苗組，且差異顯著(P>0.05)。說明商品化豬丹毒弱毒疫苗在迅速誘導免疫應答的啟動方面優于滅活疫苗。商品化豬丹毒弱毒疫苗組誘導小鼠產生的CD8+/CD3+T細胞比率高于滅活疫苗組，且與AEr32全菌體滅活疫苗組差異顯著(P>0.05)，與其他滅活疫苗組差異均不顯著 (P>0.05)，除AEr32全菌體滅活疫苗外，其他所有疫苗均能誘導小鼠免疫系統特異性殺傷或溶解靶細胞。

豬丹毒絲菌主要是通過消化道或損傷皮膚引起機體產生局部或全身性的感染[17]。當病原進入機體后，在造成機體產生永久性病理性損傷的同時，也引起機體產生一系列的抵抗反應行為。炎癥的本質是機體在應對病原菌入侵時引起損傷產生的一種防御性反應[18]。本研究結果表明，由抗原所引起的特異性免疫細胞在誘發慢性炎癥中具有重要作用[19]。在免疫效力檢驗過程中，本研究采用腹腔注射和模擬自然感染的灌胃2種方式對免疫后的小鼠進行攻毒。2種攻毒方式的攻毒對照組的小鼠全部呈急性死亡且肺臟、脾臟、肝臟及腎臟充血嚴重，腎小球、腎小囊上皮細胞及脾小體腫脹，部分肝細胞壞死。AEr21全菌體滅活疫苗組和AEr32全菌體滅活疫苗組，腹腔攻毒的保護率分別為80%和60%，灌胃的保護率分別為80%和100%。病理組織切片觀察可見小鼠的肝細胞出現變性、壞死，產生少量的肝吞噬細胞(KCs)。KCs具有吞噬血液循環的抗原抗體復合物、清除肝血竇中的細菌以及清除衰老的紅細胞等作用[20]。KCs的產生是因為免疫后的小鼠機體被病原菌刺激，增大KCs的體積，從而導致其數量上的增多。脾臟雖出現脾小體腫脹，但部分細胞核出現漸染的現象，這一現象說明免疫小鼠的機體對組織損傷進行一定的自我修復，經修復后可恢復原組織的結構和功能[9]。AEr31全菌體滅活疫苗組、商品化弱毒疫苗組和商品化滅活疫苗組對二種攻毒的保護率均為100%，且各臟器病理變化較輕，免疫效果較好。

本研究以3株豬丹毒絲菌制苗用菌株(AEr21、AEr31和AEr32)為受試菌株，礦物油佐劑ISA 201 VG作為制備滅活疫苗的免疫佐劑。在豬丹毒絲菌滅活疫苗的免疫效力研究中進一步證實：(1)滅活疫苗的免疫效果與制苗用菌株的免疫原性有關。AEr31株制備的滅活疫苗誘導小鼠產生的細胞免疫和體液免疫以及免疫保護率均最高，AEr31株制備的滅活疫苗的抗原性優于其他菌株。(2)滅活疫苗的質量與抗原的質量濃度以及免疫佐劑的性質有關。在與商品化豬丹毒滅活疫苗的免疫效力比較中，AEr31全菌體滅活疫苗組誘導小鼠產生的抗體水平和細胞因子水平優于商品化豬丹毒滅活疫苗，對免疫后小鼠能提供100%的保護，AEr31全菌體滅活疫苗可作為防控豬丹毒的候選疫苗。(3)疫苗安全性是前提，免疫效力是關鍵[21]。在與豬丹毒弱毒疫苗免疫效果比較中，雖然弱毒疫苗誘導機體產生細胞免疫和體液免疫方面優于滅活疫苗，但有研究報道，豬丹毒弱毒疫苗對于慢性型豬丹毒的效果較差，甚至會加大豬群感染關節炎的風險，免疫的效果也常受到豬群母源抗體和抗生素干擾的影響[22]。而本研究結果可有助于提高豬丹毒滅活疫苗的免疫效果，也為豬丹毒有效防控提供技術儲備。