外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗氧化脅迫及抗氧化系統(tǒng)的影響

蔣景龍，沈季雪,2，李 麗

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所， 合肥 230001:；3.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中 723001)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取籽粒飽滿(mǎn)、大小均勻的‘春夏秋王’黃瓜種子，用50 ℃溫水浸泡20 min，將其放置于蒸餾水中吸脹，6 h后于25 ℃恒溫暗箱發(fā)芽，將發(fā)芽的種子播種于裝有珍珠巖的塑料杯(65 mm× 45 mm×70 mm)中，每杯一粒種子，置于光照培養(yǎng)箱(PGX-1000B，上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司)中培養(yǎng)，光照周期為12 h/12 h，溫度為(25±1)℃，光強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1，相對(duì)空氣濕度60%。每天9:00每杯澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液15 mL,待所有幼苗第1片真葉完全展開(kāi)時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行試驗(yàn)處理。具體為：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(CK)、Hoagland+200 mmol·L-1NaCl(T0)、Hoagland+200 mmol·L-1NaCl+1 μmol·L-1H2O2(T1)、Hoagland+200 mmol·L-1NaCl+5 μmol·L-1H2O2(T2)和Hoagland+200 mmol/L NaCl+10 μmol·L-1H2O2(T3)5種處理。處理6 d后取黃瓜幼苗為試驗(yàn)材料。每處理組至少設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)8～10株黃瓜幼苗。

1.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定

1.3 蛋白提取和SDS-PAGE電泳

黃瓜葉片和根總蛋白的提取參照Wu等[20]的三氯乙酸(TCA)-丙酮法提取，方法略有改進(jìn)。取0.5 g葉片和根樣品于液氮中研磨成粉，樣品懸浮于1.5 mL預(yù)冷的TCA和w=0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液中，-20 ℃沉淀過(guò)夜，其間振蕩數(shù)次。離心棄上清液，加入等體積含0.07%β-巰基乙醇的冰丙酮溶液，靜置1 h，4 ℃、12 000×g離心，棄上清液；重復(fù)洗滌沉淀3～4次。直至上清液清亮，將沉淀真空干燥成粉末狀。在蛋白干粉中加入600 μL裂解液(7 mol·L-1尿素、 2 mol·L-1硫脲、w=4% CHAPS、65 mmol·L-1DTT、40 mmol·L-1tris-base)充分渦旋混勻，冰浴超聲促溶，4 ℃離心1 h。吸取上清液，分裝至1.5 mL Eppendorf管內(nèi)，液氮速凍后保存于 -80 ℃超低溫冰箱。

蛋白質(zhì)定量：選用BSA試劑盒法定量，分別吸取2 mg·mL-1的BSA樣品溶液0、5、10、15、20、25 μL于6個(gè)Eppendorf離心管中，并用紫外分光光度計(jì)(UV1200型，美譜達(dá)儀器公司)測(cè)定480 nm處的吸光度，繪制以蛋白量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度(A480)為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。使用Microsoft Excel 2010對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸光度與其量進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得出樣品蛋白的濃度，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的量。

SDS-PAGE電泳：在1.5 mL的Ependorff離心管中加入1∶1的蛋白樣液和電泳上樣緩沖液，充分混合后沸水浴3 min使蛋白質(zhì)變性，冷卻后上樣，上樣量為10 μg。樣品在濃縮膠中時(shí)電壓設(shè)定為80 V，指示劑跑入分離膠后將電壓調(diào)換為120 V，待指示劑跑至距離膠底部1 cm處切斷電源，取出凝膠。取出凝膠后，在水中浸泡10 min左右，然后用固定液(25%異丙醇，10%乙酸)固定蛋白1 h。用考馬斯亮藍(lán)R250染液進(jìn)行染色過(guò)夜，然后脫色液脫色，使條帶清晰。將凝膠在水中浸泡10 min，取出后放入固定液固定1 h，之后在考馬斯亮藍(lán)R250染液中染色，過(guò)夜后取出加入脫色液脫色。對(duì)凝膠進(jìn)行掃描后，Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)差異條帶。

1.4 MALDI-TOF/TOF-MS/MS蛋白鑒定與搜庫(kù)分析

膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽：每個(gè)膠粒切碎后放入Eppendorf管中，每管加入200～400 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3/30%ACN脫色，凍干后，加入5 μL 2.5～10 ng·μL-1測(cè)序級(jí) Trypsin(Promega)溶液，37 ℃反應(yīng)過(guò)夜，20 h左右；吸出酶解液，轉(zhuǎn)移至新離心管中，向管中加入100 μL 60% ACN/0.1% TFA，超聲15 min，合并前次溶液，凍干；若有鹽，則用Ziptip(millipore)進(jìn)行脫鹽。

質(zhì)譜分析：樣品與5 mg·mL-1HCCA基質(zhì)1∶1混合后，用4800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀〔4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer)(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行質(zhì)譜分析，激光源為355 nm波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，PMF質(zhì)量掃描范圍為800～4 000 u，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級(jí)MS/MS激光激發(fā)2 500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉。

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，使用以下數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析搜索：Database:NCBI；Taxonomy:Mycoplasma7442; Type of search:Peptide Mass Fingerprint(MS/MS Ion Search); Enzyme:Trypsin; Fixed modifications:Carbamidomethyl(C); Mass values:Monoisotopic; Protein Mass:UnrestrictedPeptide; Mass Tolerance:±100 ppm Fragment; Mass Tolerance:±0.4 Da; Peptide Charge State:1+；Max Missed Cleavages:1。鑒定成功標(biāo)準(zhǔn)：protein score c.i.%大于 90。蛋白得分則因蛋白長(zhǎng)度和序列不同有一些區(qū)別，大約在50～55分以上。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)的 影響

形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與CK組相比，T0組黃瓜幼苗普遍出現(xiàn)葉片萎蔫、植株倒伏和第2片真片葉生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，外源H2O2處理明顯緩解了NaCl對(duì)黃瓜幼苗的脅迫(圖1)。NaCl脅迫處理后，黃瓜幼苗葉片大小、株高、根系長(zhǎng)度和生物量等總體生長(zhǎng)特性均受到顯著影響(圖2)。與CK組相比，T0組黃瓜葉面積、株高(地上部分)、根長(zhǎng)、株鮮質(zhì)量(地上部分)、株干質(zhì)量(地上部分)、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量和葉片RWC分別減少45.1%、 9.5%、29.9%、46.1%、35.5%、48.5%、55.3%和16.3%。梯度濃度的外源H2O2對(duì)黃瓜幼苗各生長(zhǎng)參數(shù)均有顯著改善，其中T2組增加最高，較T0組黃瓜幼苗葉面積、株高、根長(zhǎng)、株鮮質(zhì)量、株干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量和葉片RWC分別增加70.7%、6.1%、26.6%、37.4%、31.6%、 77.7%、90.1%和16.4%(圖2)。

2.2 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗內(nèi)和 H2O2質(zhì)量摩爾濃度的影響

與CK組相比，T0組黃瓜幼苗葉片和根系H2O2質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，與T0組相比，外源H2O2處理組葉片H2O2質(zhì)量摩爾濃度均顯著降低，T2和T3組根系H2O2質(zhì)量摩爾濃度顯著降低，T2組下降幅度最大，下降21. 6%。

圖1 外源H2O2處理鹽脅迫下黃瓜幼苗形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of cucumber seedlings treated with exogenous H2O2 under salt stress

每個(gè)值代表“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。圖中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05) Each value represents the “mean±standard deviation”. The different lowercase letters in the same figure indicates significant difference(P<0.05)

圖2 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響
Fig.2 Effects of exogenous H2O2treatments on growth indexes of cucumber seedlings under salt stress

2.3 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗細(xì)胞膜相對(duì)透性和脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響

如圖4所示，與CK組相比，T0組黃瓜幼苗葉片和根系REC顯著增加，外源H2O2處理組葉片REC與T0組相比均顯著降低，T2組根系REC與T0組相比顯著降低，下降28.0%。

T0組黃瓜幼苗葉片和根系MDA質(zhì)量摩爾濃度與CK組相比顯著增加，分別增加86.7%和75.0%。T1和T2組葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度與T0組相比顯著降低，外源H2O2處理組根系MDA質(zhì)量摩爾濃度與T0組相比均顯著降低。

2.4 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗抗氧化的影響

如表1所示，與CK組相比，T0組黃瓜幼苗葉片GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，但根系GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著。外源H2O2處理組葉片GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)較T0組均顯著增加，均達(dá)到CK組水平，根系GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)較T0組和CK組均顯著增加。與CK組相比，T0組黃瓜幼苗葉片和根系A(chǔ)sA質(zhì)量摩爾濃度均顯著降低，T2和T3組葉片AsA質(zhì)量摩爾濃度較T0組均顯著增加，均達(dá)到CK組水平，根系A(chǔ)sA質(zhì)量摩爾濃度較T0組均顯著增加。

與T0組相比，T2組根系SOD活性顯著降低，其他組均無(wú)顯著性差異。T0組葉片CAT活性較CK組顯著降低，外源H2O2處理組的CAT活性較T0組均顯著增加，達(dá)到CK組水平，而各組根系CAT活性差異不顯著。與CK組相比，各處理組黃瓜幼苗葉片POD和GR活性顯著增加，但各處理組間POD活性無(wú)顯著差異，T0、T1和T3組間GR活性無(wú)顯著差異，但T2組中GR活性無(wú)顯著差異，但T2組中GR活性較T0、T1和T3組顯著降低；同樣，與對(duì)照組相比，各處理組 根系中POD和GR活性與葉片呈相反趨勢(shì)，均顯著降低。根中T1、T2組POD活性均顯著高于T3。

圖4 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜葉片和根系REC及MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig.4 Effects of exogenous H2O2 on REC and molality of MDA in cucumber leaves and roots induced by salt stress

處理 TreatmentGSH/(μg·g-1)AsA/(μmol·g-1)SOD/(U·mg-1)CAT/(U·mg-1)POD/(U·mg-1)GR/(U·mg-1)葉片LeafCK12.49±1.34 a4.64±.011 a9.86±0.30 a5.42±0.21 a37.30±4.10 b24.12±6.96 cT09.42±2.36 b3.21±0.12 b10.54±0.09 a4.78±0.17 b45.30±1.45 a56.27±0.00 aT111.77±0.72 a3.71±0.54 b10.40±0.65 a5.20±0.20 a44.78±5.03 a52.25±4.02 aT212.97±0.57 a4.96±0.28 a10.46±0.34 a5.49±0.05 a45.78±2.52 a35.17±6.68 bT312.38±0.92 a5.30±0.23 a10.65±0.73 a5.23±0.14 a46.67±2.30 a48.23±0.00 a根系 Root systemCK9.29±0.00 c2.39±0.29 a3.62±0.19 ab2.04±0.15 a46.78±0.59 a32.15±8.04 aT09.08±1.31 c1.39±0.04 c4.08±0.45 a1.85±0.17 a42.78±2.82 b24.12±5.68 bT111.18±0.72 b1.66±0.12 b3.53±0.63 ab1.99±0.45 a50.03±2.33 a22.11±2.84 bT212.33±0.51 a2.20±0.09 a2.84±0.25 b1.65±0.14 a46.75±1.45 a24.12±6.96 bT313.54±0.55 a2.41±0.31 a3.28±0.86 ab2.01±0.31 a42.75±3.36 b26.08±4.02 b

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

2.5 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗蛋白表達(dá)的影響

采用SDS-PAGE提取和分離總蛋白，從圖5可以看出，在鹽脅迫下，外源H2O2處理導(dǎo)致黃瓜幼苗葉片和根系中蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生變化。與CK組相比，1號(hào)蛋白條帶在T0組稍有上調(diào)，僅在T2組表達(dá)明顯下調(diào)，下調(diào)2.72倍，與T0組相比，T1和T3組表達(dá)上調(diào)，T3組上調(diào)幅度最大，上調(diào)2.26倍；2號(hào)蛋白條帶在T0和T2組表達(dá)下調(diào)，而T1和T3組上調(diào)。3號(hào)蛋白條帶在各組表達(dá)均上調(diào)，其中T0組上調(diào)幅度最大。4號(hào)蛋白條帶表達(dá)量規(guī)律與3號(hào)條帶相似，其中T1組上調(diào)幅度最大。

1,2 分別表示不同處理后黃瓜葉片的差異蛋白條帶 1,2 respectively indicate the differential protein bands of cucumber leaves after different treatments; 3, 4分別表示不同處理后黃瓜根的差異蛋白條帶 3 and 4 respectively indicate the differential protein bands of cucumber roots after different treatments

圖5 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下黃瓜蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響
Fig.5 Effects of exogenous H2O2on changes of relative expression ofprotein in cucumber leaves and roots induced by salt stress

對(duì)上述4個(gè)差異蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析與鑒定，4個(gè)蛋白條帶均鑒定成功。經(jīng)過(guò)鑒定，1號(hào)蛋白推測(cè)為甲基轉(zhuǎn)移酶PMT5，2號(hào)蛋白可能為鐵氧還蛋白依賴(lài)型谷氨酸合成酶(Fd-GOGAT)，3號(hào)蛋白條帶為網(wǎng)格蛋白重鏈1(CHC1)，4號(hào)蛋白條帶檢測(cè)結(jié)果為熱休克蛋白70樣蛋白15(表2)。

表2 差異蛋白質(zhì)譜鑒定Table 2 Differentially expressed protein bands identified by MALDI-TOF/TOF-MS from SDS-PAGE gels

3 結(jié)論與討論

通過(guò)SDS-PAGE比較不同處理下黃瓜幼苗葉片及根系蛋白表達(dá)的差異，根據(jù)MALDI-TOF-MS結(jié)果顯示，推測(cè)1號(hào)蛋白為甲基轉(zhuǎn)移酶PMT5，PMT5為Jak激酶結(jié)合蛋白(JBP1)，可與多種蛋白同時(shí)存在組成復(fù)合物。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)PRMT5的功能缺失會(huì)導(dǎo)致擬南芥對(duì)鹽脅迫高度敏感，使其喪失協(xié)調(diào)鹽脅迫耐受和生長(zhǎng)發(fā)育的能力。在正常生長(zhǎng)條件下，PRMT5結(jié)合在染色質(zhì)上催化H4R3對(duì)稱(chēng)性雙甲基化，從而抑制FLC和一系列脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)；當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，PRMT5從染色質(zhì)上解離，導(dǎo)致H4R3對(duì)稱(chēng)性雙甲基化水平降低以及FLC和脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)升高，從而促進(jìn)植物在鹽脅迫環(huán)境下正常的生長(zhǎng)發(fā)育[28]。本研究中1號(hào)蛋白條帶與對(duì)照組相比，鹽脅迫后有輕微上調(diào)趨勢(shì)，但不明顯，而隨著外源H2O2處理濃度的升高，則表現(xiàn)明顯的上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)的趨勢(shì)，這表明外源H2O2處理可能引起甲基轉(zhuǎn)移酶PMT5表達(dá)變化，而具體的原因尚不清楚，仍需要進(jìn)一步深入研究。2號(hào)蛋白可能為鐵氧還蛋白依賴(lài)型谷氨酸合成酶，在鹽脅迫后明顯下調(diào)，該結(jié)果與Popova等[29]研究鹽土植物冰草經(jīng)鹽刺激后，鐵氧還蛋白依賴(lài)型谷氨酸合成酶在葉片中的活性及轉(zhuǎn)錄水平降低相一致。而H2O2處理后則出現(xiàn)了上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)的趨勢(shì)，有趣的是1號(hào)蛋白和2號(hào)蛋白在H2O2處理時(shí)均表現(xiàn)出1 μmol·L-1和10 μmol·L-1處理引起蛋白的變化規(guī)律一致，而5 μmol·L-1處理則表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，這可能與信號(hào)分子H2O2的劑量效應(yīng)有關(guān)。3號(hào)和4號(hào)蛋白分別為網(wǎng)格蛋白重鏈1(CHC1)和熱休克蛋白70樣蛋白15，這2個(gè)蛋白在鹽脅迫后均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，而與鹽脅迫組相比，H2O2處理引起網(wǎng)格蛋白重鏈1(CHC1)下調(diào)趨勢(shì)，而熱休克蛋白70樣蛋白15則表現(xiàn)出繼續(xù)上調(diào)趨勢(shì)。網(wǎng)格蛋白參與調(diào)控細(xì)胞抗逆反應(yīng)，其介導(dǎo)的內(nèi)吞是植物細(xì)胞膜蛋白內(nèi)吞的主要途徑，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育在逆境響應(yīng)過(guò)程中呈現(xiàn)可塑性的重要機(jī)制之一[30]。熱休克蛋白70(HSP70)是大多數(shù)生物體內(nèi)含量最多的一類(lèi)熱休克蛋白，它的表達(dá)在細(xì)胞應(yīng)激的情況下獲得增強(qiáng)，參與各種機(jī)體細(xì)胞的保護(hù)，使植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力增加[31]。在鹽脅迫下，H2O2處理引起了網(wǎng)格蛋白重鏈1(CHC1)的下調(diào)和熱休克蛋白70樣蛋白15上調(diào)，表明這2種蛋白可能參與H2O2處理介導(dǎo)緩解黃瓜鹽脅迫響應(yīng)，而表達(dá)的模式則相反，具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。本研究初步探討了H2O2在黃瓜幼苗耐鹽能力提高的生理及蛋白方面的影響，但是對(duì)于調(diào)控機(jī)理及基因表達(dá)機(jī)制等需要進(jìn)一步研究。