循環腫瘤DNA研究進展及其臨床應用現狀＊

高明正，張 瑾，潘 云，李 艷

循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）可以利用患者的血液及其他體液（如尿液、唾液等）檢測癌癥的成分及來源。循環腫瘤DNA作為液態活檢（liquid biopsy）中的一部分，能夠實時反映腫瘤狀態，通過對其檢測可以快速實現疾病分子的鑒定，有利于疾病的早期診斷、準確預后、疾病監測及個體化治療。隨著科技及醫療的不斷進步，腫瘤分子研究的不斷深入，ctDNA與腫瘤相關的研究不斷被報道，下面就對ctDNA進行詳細介紹。

1 ctDNA的生物學特征

ctDNA，指外周血液循環系統中腫瘤基因組的游離DNA，這些游離的片段反映了腫瘤的信息［1］循環游離 DNA（circulating free DNA，cfDNA）即非細胞結合的DNA，存在于血清或血漿細胞外的DNA，是無創唐氏篩查的基礎。1948年mandel等［2］首次描述了人血液中循環游離DNA。隨后Leon等［3］于1977年發現cfDNA的濃度在癌癥患者中明顯高于非癌癥患者，開辟了后續一系列的研究。ctDNA來源于腫瘤的壞死、腫瘤凋亡、腫瘤細胞直接分泌以及外泌體的釋放［4-7］。 cfDNA 含量及完整性［8-10］ctDNA 突變頻率［11-13］、微衛星雜合性［14］以及甲基化頻率［15-17］這些都可以進行研究。cfDNA片段大小不一，主要受到提取方法、腫瘤釋放方式的影響，測序發現cfDNA的大小主要集中在180 bp左右，長度為包裹在核小體蛋白復合物上DNA的長度［18-19］。且對于非突變的cfDNA來說，長度要長于ctDNA［20］。ctDNA的含量通常占總循環游離DNA的0.01%［21，22］這對臨床檢測來說是一種挑戰。cfDNA的半衰期較短，數min到2.5 h不等，可以實時監測體內ctDNA的變化［23-25］。

2 ctDNA檢測的相關技術

ctDNA帶有與原發腫瘤相關的遺傳信息，在研究腫瘤的發生發展、個體化醫療具有重大意義。半衰期比較短，能夠精確評估數小時的腫瘤變化，比影像學或蛋白標記早數周甚至數月發現腫瘤的改變；較高的特異性，避免了假陽性的結果；代表腫瘤負荷，能評估腫瘤的動態；濃度水平隨著疾病進展而增加，也會因為藥物治療或者手術而降低，可以檢測腫瘤對于治療的反應、評估患者治愈情況及殘留病灶情況，從而防止疾病的復發；臨床通過對腫瘤相關分子的檢測揭示腫瘤發生的機制，從而對作用靶點“對癥下藥”，精準治療到每例患者與精準醫療的主題相契合。雖然技術應用場景廣闊、優勢明顯、市場潛力巨大，但是在實際的臨床應用和推廣方面還面臨著一系列的挑戰，比如數量少、需要擴增、檢測方法靈敏性較低，如何進行高效的捕獲與檢測成為重要環節。隨著科技的發展、醫療水平的提高，相對應地更特異性與靈敏性的捕獲檢測技術被開發出來。

檢測ctDNA的技術主要有：Sanger法、實時熒光定量 PCR（real-time PCR，RT-PCR）、二代測序技術（next generation sequencing，NGS）、突變擴增系統（amplification refractory mutation system，ARMS）、質譜法 （mass spectrometry，MS）、數字 PCR（digital PCR，dPCR）： 包括 BEAMing和微滴式數字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）。 標記擴增深度測序（TAM-Seq）、 癌癥個體化深度測序 （CAPP-Seq）等（表1）。利用這些技術對ctDNA進行檢測，及時了解患者病情從而達到治療腫瘤的目的。下面是ctDNA相關檢測技術各自特點介紹。

2.1 Sanger法1977年 Sanger等［26］首先用于噬菌體x174的基因測定，在被科學家稱作 “登月計劃”的人類基因組計劃 （human genome project，HGP）中Sanger法發揮了重要作用。該法利用了雙脫氧鏈終止的原理。Beaver等［27］通過對29例早期乳腺癌患者的腫瘤組織和血漿的PIK3CA進行研究，檢測到腫瘤組織與血漿中的突變，對患者的復發風險的評估、指導患者的化療具有重要意義。Sanger法具有檢測明確、成本低、準確率高等優點，但通量低也限制其無法滿足當前的高通量測序的需要。

2.2 NGS新一代測序技術。通過平行測序、邊合成邊測序的思想。測序的大致流程包括：DNA文庫的構建、文庫分子克隆擴增、測序及分析。以高通量、高靈敏度、高精確度等優勢在ctDNA中檢測多個已知或未知突變而廣泛應用，Forshew等［28］通過對卵巢癌患者的TP53、EGFR、KRAS的檢測，這種高通量的方法可以作為一種無創的 “液體活檢”方式，方便分析ctDNA，用于個體化癌癥基因組學的研究。Narayan等［29］對非小細胞肺癌的研究，NGS可以作為一個實際的診斷測試的基礎來測量血液中來源于腫瘤的DNA水平。

2.3 ARMS-PCR擴增阻滯突變系統。是在PCR的基礎上建立起來的［30］，利用PCR與凝膠電泳可以檢測DNA的點突變。引物的3′端堿基與模板的堿基如果不互補，一般的耐熱DNA聚合酶則無法進行延伸，ARMS-PCR就是根據已知點突變來設計3條引物，3′端堿基會分別與正常和突變的模板堿基互補配對，從而將有點突變的模板與正常模板區別出來。因其操作簡便、用時較短、成本低等優點，廣泛應用于各種基因的多態性研究。Board等［31］研究發現PIK3CA的突變在76例乳腺癌的血清與腫瘤組織的一致性為95%，PIK3CA可以作為一種預測性生物標志物。

2.4 數字PCR該技術的出現在ctDNA的研究中發揮了重要作用，相較于普通的PCR，數字PCR能夠直接計數DNA的個數，實現對樣本的絕對定量。尤其適用于Ct值不能很好發揮的領域。微滴式數字PCR，利用陰性體系與陽性體系的數量，泊松分布的原理，計算出目的片段的絕對拷貝數［32］。在進行傳統的PCR擴增前需對樣本進行相應的微滴化處理，通過油包水結構，生產20 000個均一的微滴，每個微滴都是獨立的體系。PCR擴增后對每個微滴進行檢測，有熒光的標記為1，反之則為0，可以得到 靶 分 子 的 濃 度 和 拷 貝 數 。 Hindson等［33］在analytical chemistry雜志上發表了微滴式數字PCR在DNA拷貝絕對定量的應用，具有里程碑的意義，使得該技術在ctDNA的研究中更加規范化。Bettegowda等［16］評估 640例不同類型癌癥患者，發現不同疾病的檢測率不同，卵巢癌、胰腺癌、結腸癌等檢測率比腎癌、腦癌、甲狀腺癌、前列腺癌要高一些，在對其中206例轉移性結直腸癌患者研究中，檢測ctDNA中的KRAS突變敏感性（87.2%）、特異性（99.2%），這些都表明ctDNA是一種廣泛適用、特異性和敏感性的生物標志物。

表1 ctDNA相關檢測技術介紹

2.5 BEAMing數字PCR與流式技術的結合，特異性PCR引物擴增完目標突變區域后，與磁珠（帶有特異PCR引物）混合后進行油包水結構的擴增反應，利用帶顏色的熒光探針結合磁珠上的特異PCR產物，再用流式細胞儀分析磁珠的顏色從而確定突變的情況。Diehl等［24］對18例結腸癌患者中192份血漿樣本ctDNA突變情況進行分析，檢測靈敏度可達0.005%。

2.6 其他檢測技術在ctDNA的研究中，實時熒光定量 PCR也被應用［34］。此外質譜法，通過離子飛行時間的判讀，測出其分子質量。用于ctDNA的最大優勢是準確性高、穩定性強、重復性好、速度快、樣本標準化處理。對基因突變、基因分型、DNA甲基化、基因表達、單倍體序列差異、拷貝數變異等多項檢測與分析［35］。 TAM-Seq，用特異性引物進行循環目標區域的預擴增，再利用不同特性的接頭標簽繼續第二次擴增。雙向重復測序提高了測序的精度，高突變頻率、高敏感性、高特異性、低成本都有利于臨床應用［36］。 CAPP-Seq，用定制化的突變位點庫做“篩選器”，相應的樣本進行靶向捕獲然后進行深度測序，用于ctDNA的研究靈敏度及特異性更強，價位合適［28］。

3 ctDNA的臨床應用

現在腫瘤診斷面臨的問題是早期診斷比較困難，患者往往錯過最佳治療時機；放化療產生藥物耐藥性，缺乏有效的治療靶點；易復發轉移，預后較差等。因此早發現、早診斷、早治療，實時檢測、靶向用藥、個體化診療是提高腫瘤遠期生存率降低病死率的關鍵。目前，ctDNA作為一種廣泛應用前景的腫瘤標志，可以用于腫瘤患者早期診斷，腫瘤發展過程檢測、判斷預后、個性化指導用藥。現今關于ctDNA的應用研究日益增多。

3.1 早期診斷及腫瘤發展過程檢測對于腫瘤患者來說，傳統的影像學、病理檢測等往往都是疾病發展的晚期，不能夠早期及時診斷，是延誤腫瘤治愈的主要原因。cfDNA是腫瘤負荷的反應，腫瘤患者血漿中的含量要明顯高于非腫瘤患者，對其進行定量檢測并且與ctDNA體細胞突變結合，能夠更好地提供有效信息。對孕婦血液檢驗，進行無創唐氏篩查，確定患兒疾病的風險，這是液態活檢臨床最常用的方法。在一項對不同單基因風險的孕婦血液樣本的檢測中，正確區分受累和未受累的妊娠，并且在第一周就檢測出第一個受累的妊娠。胎兒分數低至3.7%［37］。這對疾病的早期診斷、疾病管理、減少并發癥具有重要意義。胰管腺癌（PDAC）是最常見的惡性腫瘤，發現后往往預后很差，對52例胰管腺癌術前血漿凝固酶敏感蛋白-2（THBS2）、CA19-9進行測定，ctDNA進行定量分析。Logistic分析發現將CA19-9、THBS2及cfDNA三者結合統計值增加到了0.94。這種組合為早期胰管腺癌的早期無創診斷奠定了基礎［38］。 Zhang 等［39］對卵巢癌、卵巢囊腫及健康患者的血液樣本進行對照，發現ALU-219濃度和ALU-219/ALU-115比值可以作為卵巢癌的診斷標志物，血漿ALU水平的檢測可以單獨或者聯合應用于卵巢癌的早期診斷，此外還可采用可重復的方法實時監測腫瘤在疾病進展過程中的演變。

3.2 判斷預后在一項對155例肝癌患者手術切除的研究，胰島素樣生長結合蛋白-7（IGFBP7）甲基化組要明顯高于非甲基化組，Kalian-Meier曲線表明，IGFBP7甲基化與總生存率顯著相關（P＜0.001），且IGFBP-7甲基化是肝癌肝切除術后和早期腫瘤復發的獨立預測因子（P=0.008）［40］。 Soliman 等［41］在非小細胞肺癌 （NSCLC）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、健康患者血漿中 ALU-215、ALU-247及cfDNA含量進行研究，發現非小細胞肺癌的含量明顯高于后兩者，血清中cfDNA在NSCLC無創血液篩查中有很好的應用前景，且cfDNA升高與患者的預后相關。Lee等［42］利用 5736例乳腺癌血液中ctDNA 進行液態活檢，TP53、ESR1、PIK3CA 的突變頻率分別為38%、32%、27%。ctDNA突變可以預測疾病復發和不良的預后。Bernard等［43］對34例患者123份血液樣本進行外顯子和ctDNA的縱向分析，包括COX回歸、Fisher檢驗、Bayesian推斷，將外顯子和ctDNA的KRAS突變與預后聯系在一起，顯示外顯子和ctDNA水平的升高與疾病的進展顯著相關（P＜0.003），外顯子和ctDNA的使用提供了與治療相關的預測和預后信息。

3.3 個性化指導用藥通過對酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療的EGFR突變的非小細胞肺癌的研究，治療后患者EGFR突變狀態顯著改變，治療后突變狀態的改變可以指導臨床醫師進行個性化用藥［44］。最近在術后監測下對結直腸癌患者的研究表明ctDNA復發的證據可能發生在臨床檢測前幾個月，ctDNA的另一個可能作用是進一步評估CEA或CT不能夠確定的結果，能夠更早地診斷出來從而有利于對患者及時用藥。對45例結直腸癌血液樣本的評估中，有14例（31%）檢測到了ctDNA，在兩年的隨訪中，21例患者 （47%）出現復發，檢測到的ctDNA與較低的無復發生存率相關 （HR 4.85，P＜0.01），對于不確定的結腸癌患者，ctDNA的分析是有必要的，早期發現有利于早期個體化治療［45］。一項對于轉移性前列腺癌的液態活檢中，53例患者在治療過程中檢測ctDNA，經短期（中位數22d）雄激素剝奪治療（ADT）后，患者的ctDNA和DNA的中位數分別為 11%（0～84%）和 1.0%（0～51%），在 47%和21%的隊列中，TP53突變和DNA修復效果分別被識別，配對樣本一致檢測率為80%［46］。ctDNA能夠提供患者的突變信息，將其與原發組織結合是評估分子亞型的最佳方法，有助于個體化精準醫療下對患者的靶向治療。

總之，伴隨著腫瘤發生發展機制的不斷闡明，影響腫瘤調控的內外環境因素及耐藥機制等不斷研究，ctDNA在腫瘤檢測領域的運用受到越來越多的重視。ctDNA以方便、實時、侵害性小和鑒別診斷能力強等優勢，可以對腫瘤的演化和適應性改變以及藥物治療效果進行實時監控，從而更能有效指導臨床對腫瘤早期診斷、檢測發展過程、判斷預后及個體化用藥。但是ctDNA數量少、需要擴增、對檢測方法的靈敏性要求高，相信在不久的將來隨著精準醫療的不斷發展，液態活檢在各種疾病中的不斷應用，ctDNA將以其獨特的方式，在未來腫瘤的檢測實踐中嶄露頭角。