全氟化碳汽化吸入對原發肺沖擊傷犬肺組織相關microRNA的影響＊

李懷東，張兆瑞，陳良安

原發肺沖擊傷（primary blast lung injury，BLI）是指爆炸時產生沖擊波超壓直接作用于胸部造成的肺損傷［1，2］。 BLI是導致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的重要病因，病死率高［3］。 近年來，全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）作為呼吸攜氧介質治療ARDS引發了液體通氣研究的熱潮。PFC以其攜氧能力強、溶解和釋放氧快（10毫秒內）等特點［4］，已經用于液體通氣中霧化或汽化吸入治療ARDS的實驗研究，可能通過抑制中性粒細胞的活化和減少中性粒細胞在肺內的遷移和募集［5］、抑制巨噬細胞釋放炎性分子［6］、抑制NF-κB的活化和抑制MAPK通路［7］等機制，從而提高動脈血氧分壓，改善氧合、提高肺臟順應性，減輕肺組織的炎癥反應，有助于改善ARDS的預后和轉歸［7］。

microRNA（miRNA）是在真核生物中存在的一類內源性的具有調控功能的非編碼小RNA分子（長度約22個核苷酸），在轉錄和轉錄后水平調控基因的表達［8］。miRNA通過與靶mRNA特異結合，抑制轉錄后基因表達，在細胞周期、生物體發育時序等方面起重要作用。miRNA在ARDS敏感性上起著潛在的關鍵作用，且在多種炎癥性肺病中發揮著影響［9］。miRNA芯片技術是高通量研究miRNA的有效的手段，已經在腫瘤、心血管疾病等學科開展了分子機制的相關研究。該研究通過miRNA芯片篩選PFC作用BLI犬相關的miRNA及其靶基因，探討汽化吸入PFC能否通過miRNA的表達來調控BLI相關基因的變化，為深入研究PFC的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料及儀器 小型沖擊波發生器（北京理工大學爆炸科學與技術重點實驗室）；PB7200呼吸機（美國Puritan-Bennett公司）；全氟辛烷（上海華捷視醫療設備有限公司）；FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit（批號：20131127）；GeneChip○ R Hybridization （批號：20131216）；AMBION 動物試劑盒 （批號：20130523）；掃描儀、雜交爐、洗滌工作站、2100振蕩器、NanoDrop、PCR儀 （美國Affymetrix公司）；離心機、濃縮儀（德國eppendorf公司）；金屬浴-2、金屬浴-3（杭州博日科技有限公司）。

1.1.2 實驗動物 經解放軍總醫院倫理委員會（解放軍總醫院福利倫理審查批號：2012-D6-06）審核通過，該實驗采用8～15月齡健康雜種犬18只（購自北京綠源偉業養殖場），雌雄不限，體重9.0～12.0 kg，平均（10.84±1.60）kg，由解放軍總醫院動物實驗中心（實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0062）室溫飼養3 d。采用隨機數字表法隨機分為2組，每組9只。

1.2方 法

1.2.1 分組 犬稱重后選取四肢淺靜脈注射3%戊巴比妥鈉（25～30 mg/kg）麻醉后綁縛四肢取仰臥位于手術臺上固定。采用北京理工大學爆炸科學與技術重點實驗室研制的小型沖擊波發生器，按照實驗流程制備肺沖擊傷犬模型［10］。分為兩組：單純肺沖擊傷組（BLI組，縮寫為B組，n=9）：制作原發肺沖擊傷模型成功后，觀察7 h。肺沖擊傷PFC汽化吸入通氣組（BLI+MV+PFC 組，縮寫為 BMP 組，n=9）：制作原發肺沖擊傷模型成功后，在常規機械通氣基礎上（容量控制，呼吸頻率（f）為 16 次/min；潮氣量（Vt）為 10 ml/kg；吸呼比（I∶E）為 1∶1.5；吸入氧濃度（FiO2）為0.6；外源性呼氣末正壓（PEEP）為5 cmH2O；恒定流速波送氣。調整好后至機械通氣結束不改變呼吸機參數設定），經呼吸機吸氣管路應用濕化罐裝置加熱（調整濕化器溫度至48～50℃加熱PFC）蒸發給予 PFC（10 ml/kg·h）連續汽化吸入治療 2 h，然后繼續常規機械通氣5 h。實驗犬處死后立即開胸解剖取出致傷肺葉眼科剪剪取約2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm肺組織多塊分裝入凍存管中立即置入液氮罐中速凍保存備用。

1.2.2 樣本處理 總RNA的提取：液氮罐中取出凍存的實驗犬肺組織，眼科剪剪取10 mg肺組織，移入加入適量液氮的研缽中，快速用力研磨成勻漿，移入勻漿器中加入10倍體積的lysis/binding buffer（1 ml lysis/binding buffer/0.1 g 組織）徹底混勻。加入1/10體積的Homogenate additive，渦旋振蕩器充分混勻，冰上放置10 min（以上操作在冰上）。加入與 lysis（不計 Homogenate additive）相同體積 的 acid-phenol：chloroform （300 μl lysis/300 μl acid-phenol：chloroform），渦旋混勻 30～60 s，室溫10 000 g離心5 min。取上清置入一新管中，記錄體積。加入1.25倍體積無水乙醇，渦旋振蕩器充分混勻，反復過純化柱，體積不超過 700 μl，10 000 g 離心 15 s。加入 350 μl wash 1，離心 5～10 s，清洗純化柱，10 000 g 離心 15 s，棄過濾液。 DNase I 10 μl和Buffer RDD 70 μl加入膜上（QIAGEN#79254），20～30℃放置 15min。加入 350μl wash 1，離心 5～10s，清洗純化柱，10000g離心15s，棄過濾液。加入500μl wash 2/3，離心 5～10 s，清洗純化柱兩次，10 000 g 離心15 s，棄過濾液，離心1 min。將離心柱放置到新的收集管中，柱中心加入 100 μl 95℃預熱的Elution Solution或nuclease-free水，室溫最高轉速離心 20～30 s，收集管中液體即為提取的 Total RNA，繼續實驗或放置在-70℃冰箱中保存。樣品總RNA利用NanoDrop ND-2100 （Thermo Scientific）定量，并應用Agilent 2100檢測RNA的完整性?？俁NA加尾、生物素標記、芯片雜交及洗脫、洗滌、染色和掃描等步驟，按照芯片標準流程進行。

1.2.3 圖像采集與數據分析 采用Affymetrix Gene Chip Command Console 軟件（version4.0，Affymetrix）處理原始圖像，用Expression Console（version1.3.1，Affymetrix）讀取原始數據并進行RMA標準化。再利用 Genespring軟件 （version 12.5；Agilent Technologies）進行后續處理。標準化后的數據進行探針過濾，用于比較的每組樣本中，至少有一組100%標記為“P”的探針留下進行后續分析。利用Fold Change檢驗的倍數變化值進行篩選差異miRNA，篩選的標準為上調或者下調倍數變化值≥2.0。

2 結果

2.1 樣本質檢報告取B組不同犬肺組織樣品5個 （每個0.1 g）和BMP組不同犬肺組織樣品5個（每個0.1 g），送上海歐易生物醫學科技有限公司檢測樣本，結果見表1。

2.2 兩組樣本miRNA芯片標準化數據將B組和BMP組犬肺組織經miRNA芯片處理后的單熒光芯片的原始數據經過標準化處理，兩組數據總體分布具有對稱性，分布集中。項目總體評價為成功。見圖1。

表1 RNA（包含miRNA）Agilent 2100法質檢結果

圖1 BMP-G vs.B-G信號雜交散點圖

2.3 篩選差異表達的miRNA應用Affymetrix miRNA 4.0芯片篩選，共有20條miRNA表達上調，3條miRNA表達下調 （表2，表3）。推測這些miRNA可能與PFC的作用存在關聯。

表2 差異miRNA的統計

表3 Affymetrix miRNA 4.0芯片篩選得到的差異miRNA列表

2.4miRNA芯片數據的基因功能富集分析miRNA序列數據為miRBase 20.0數據庫，mRNA序列為犬的mRNA 3'UTR序列數據。對差異miRNA進行靶基因預測，靶基因共449個。統計每個GO條目中所包括的靶基因個數，并用統計檢驗的方法計算每個GO條目中靶基因功能富集的顯著性。GO功能富集分析這些靶基因主要涉及分子功能（molecular function）、細胞組成（cellular component）、生物過程（biological process）等功能。 見圖 2。

應用KEGG數據庫對靶基因進行pathway分析，并且用統計檢驗的方法計算每個pathway條目中靶基因功能富集的顯著性。Pathway功能富集分析這些靶基因主要與癌癥信號通路、細胞焦點粘連通路、細胞因子受體間相互作用通路等有關。見圖3。

3 討論

miRNA通過與靶mRNA特異結合，在轉錄和轉錄后水平調控基因的表達［11］，在多種生理病理過程中發揮至關重要的作用。目前研究發現，miRNA與免疫反應［12］和炎癥通路［13］有關，也與炎癥性肺病密切相關［14］，尤其在動物模型實驗上，miRNA表達改變與ARDS的病理生理進程和信號轉導途徑相關聯，miRNA在ARDS敏感性上起著潛在的關鍵作用，已成為 ARDS新的治療靶點［15］。研究表明，miR-150［13］、miR-16［16］、miR-127［17］、miR-494［18］參 與 了ARDS炎癥過程。由miRNA引起的相關基因表達變化可能會影響到大量的后續基因的表達，繼而對機體多種生物學過程產生影響。對ARDS相關miRNA靶基因進行調控干預可能是防治ARDS的新策略。

有研究［18］發現抑制miR-494表達可作為膿血癥相關ARDS大鼠模型的治療選擇。

圖2 差異miRNA的GO富集分析

圖3 差異miRNA的KEGG pathway富集分析

miRNA芯片技術廣泛應用于人類和動物生命科學的基礎研究中，如鑒定生長、分化、細胞凋亡、信號轉導及鑒定疾病相關基因等。該研究采用Affymetrix基因芯片技術篩選PFC作用BLI犬相關的miRNA。結果篩選到23條差異表達的miRNA及預測的靶基因449個，在基因Gene Ontology數據庫和KEGG PATHWAY數據庫進行差異miRNA的GO富集分析和pathway富集分析，涉及相關的功能和通路，可能是PFC作用BLI犬相關的miRNA及其靶基因。通過差異基因的GO富集分析，可以尋找PFC作用BLI犬肺組織相關的靶基因可能和哪些基因功能的改變有關。GO富集分析預測靶基因共449個，主要涉及分子功能、細胞組成、生物過程等功能。Pathway富集分析可以尋找PFC作用BLI犬肺組織的差異基因可能和哪些細胞通路的改變有關。Pathway富集分析這些靶基因主要與癌癥信號通路、細胞焦點粘連通路、細胞因子受體間相互作用通路等有關。pathway富集分析的PFC作用BLI犬相關的miRNA23條，進而影響靶基因的轉錄表達，為進一步后期蛋白質功能實驗［如蛋白質印記（Western blot）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA），免疫組化 （IHC）， 過表達 （over expression），RNA 干擾（RNAi），基 因 敲 除 （knockout），轉 基 因 （transgene）等］的支持、驗證和探討提供了數據資料，也為深入理解和研究PFC對基因表達的影響提供了分子水平的理論依據。miRNA調控基因的表達非常復雜，在不同疾病、不同組織、不同生理病理階段都不相同，而且一個miRNA標靶許多的基因。因此，基因芯片篩選是為后續的研究提供線索和方向，明確作用機制還距離甚遠。將來需要進一步對篩選獲得的miRNA進行QRT-PCR驗證和靶基因預測，以完善和加強對miRNA在BLI中的作用及PFC可能的分子調控機制。該實驗提示，全氟化碳汽化吸入可能通過影響肺沖擊傷犬肺組織相關miRNA及其靶基因的表達發揮生物學作用。