保鮮盒包裝冷鮮牛肉貯藏期間品質及菌相變化

付麗，高雪琴，胡曉波，*，郝修振，馬路石

（1.河南牧業經濟學院食品工程系，河南 鄭州 450046；2.河南伊賽牛肉股份有限公司，河南 焦作 454450）

牛肉營養豐富、高蛋白質、低脂肪，早已是中國人主要消費的肉類，且在肉類消費中的比重增加最快[1]，預測我國2025 年牛肉需求量可達到1 200 萬噸[2]。冷鮮牛肉更是具有鮮嫩、美味、安全、衛生等優點而深受消費者喜愛[3]，在發達國家達100%的市場占有率[4]。但由于0 ℃～4 ℃貯存并不能完全抑制微生物的生長，貯藏、運輸、銷售過程中易受污染而發生腐敗變質，造成冷鮮牛肉貨架期短。近年來，國內外有關屠宰后牛胴體減菌技術、冷鮮牛肉保鮮技術的研究報道較多，但對于牛肉初始菌相以及冷藏過程中品質及菌相變化的研究較少，由于缺少理論基礎研究，使得保鮮技術、減菌技術的針對性不強，效果不佳，因此進行冷鮮牛肉貯藏過程中品質變化及菌相變化的研究具有重要意義。

本試驗以冷鮮牛肉為研究對象，測定其在0 ℃～4 ℃條件下貯藏第0、1、3、5、7 天時的感官指標、揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N 值）、pH 值、硫代巴比妥酸反應物值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS 值）、菌落總數和大腸菌群等指標的變化并進行指標間相關性分析，研究冷鮮牛肉貯藏期間感官品質、新鮮度的變化；采用選擇性培養基對0 ℃～4 ℃下貯藏第 0、1、3、5、7 天的冷鮮牛肉中乳酸菌、假單胞菌、腸桿菌以及熱死環絲菌的生長情況進行測定，初步分析冷鮮牛肉貯藏過程中的優勢腐敗菌，為冷鮮牛肉保鮮新技術的開發提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉（牛后腿肉）：由河南伊賽牛肉股份有限公司提供。宰前檢驗合格的活牛屠殺后，進行排酸后剔骨分割，并由冷藏車在0 ℃～4 ℃條件下2 h 內運輸到實驗室。

氧化鎂、硼酸、鹽酸、甲基紅、三氯乙酸、KCl、甘油等（均為分析純）：河南華豐試劑股份有限公司。

平板計數瓊脂培養基、CFC 選擇性培養基、STAA選擇性培養基、VRBGA 選擇性培養基、MRS 瓊脂培養基（均為生物試劑）：河南華豐股份有限公司。

塑料保鮮盒（方形，650 mL）：蘇州康百樂餐飲用品公司。

1.2 儀器與設備

DHP-080 電熱恒溫培養箱：鄭州生元儀器有限公司；SHA-B 水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾股份有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療儀器公司；K9840 半自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；BlueStarB 紫外可見分光光度計：北京萊泊泰科股份有限公司；PHSJ-3F 酸度計：上海儀器海電股份偶限公司；2.5L 厭氧培養罐：日本三菱瓦斯化學株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 肉樣的處理

先開啟無菌室紫外燈照射30 min 后，再將肉樣拿入無菌室。在無菌條件下打開包裝取出牛肉，剔除表面結蹄組織、多余脂肪、筋膜等，用無菌刀和案板將牛肉切成 5 cm×5 cm×5 cm 大小肉樣，共 30 塊，將處理好的肉樣在無菌的條件下充分混合以保證肉樣初始菌數一致。將肉樣分為5 組，每組6 塊，分別裝入事先編號的無菌保鮮盒內，加蓋，放于0 ℃～4 ℃的冷鮮庫貨架上，備用。

1.3.2 保鮮盒包裝冷鮮牛肉貯藏期間感官品質及新鮮度的變化

分別在貯藏第 0、1、3、5、7 天時從冷庫內取出肉樣，每次3 盒。檢測肉樣的感官指標、揮發性鹽基氮值（TVB-N）、pH 值、硫代巴比妥酸反應物值（TBARS）、菌落總數、大腸菌群數的變化及指標間相關性分析，研究肉樣貯藏期間感官品質及新鮮度的變化。

1.3.3 保鮮盒包裝冷鮮牛肉中菌相的初步分析

分別在貯藏 0、1、3、5、7 天時從冷庫內取出肉樣，每次3 盒。在無菌條件準確稱取絞碎的肉樣25 g，放入盛有225 mL 無菌生理鹽水的均質袋中，然后放入均質機中拍打均質30 s 獲得10-1稀釋菌液，逐級稀釋。選擇2～3 個合適稀釋度的菌液，采用涂布法接種于CFC、STAA、MRS 瓊脂及 VRBDA 瓊脂 4 種選擇性培養基中，每個稀釋度做個重復，待凝固后編號，倒置恒溫培養，進行菌數計數，研究保鮮盒包裝冷鮮牛肉中優勢腐敗菌的生長變化，觀察菌落形態并進行革蘭氏染色、動力學試驗等進一步菌種鑒定。根據《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌手冊》對典型菌落進行氧化酶、過氧化氫酶及精氨酸雙水解酶試驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 感官指標

參照GB/T 22210-2008《肉與肉制品感官評定規范》[5]中感官指標評定方法及孫凱旋等[6]感官評價方法并稍做改動。由10 名食品專業人員組成評定小組，評定指標包括色澤、氣味、黏度、彈性四項，每項滿分均為25 分，采用百分制，四項指標評分加合為肉樣的總評分。感官指標評分標準見表1。

表1 感官指標評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4.2 TVB-N 測定

測定方法按GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》[7]中的半微量凱氏定氮法進行。將肉樣絞碎混勻后，取10 g 放于干凈的消化管內，加入75 mL 蒸餾水，靜置30 min，加入1 g 氧化鎂。用全自動凱氏定氮儀進行TVB-N 值測定。其值≤15 mg/100 g 為一級新鮮牛肉，≤20 mg/100 g 為二級，≥20 mg/100 g 時則為變質肉[8-9]。

1.4.3 pH 值測定

取絞碎的肉樣40 g，放于盛有100 mL 0.1 mol/L KCl 溶液的燒杯中，參照GB/T 5009.237-2016《食品安全國家標準食品pH 值得測定》[10]進行測定。正常冷鮮牛肉 pH 值為 5.8～6.2，次級鮮肉 pH 值為 6.3～6.6，變質肉 pH＞6.7[11]。

1.4.4 TBARS 值測定

測定方法按GB 5009.181-2016《食品安全國家標準食品中丙二醛的測定》[12]中分光光度法進行。當TBARS 值大于0.5 mg/kg 時，就會產生因脂肪氧化而產生的酸敗味[13]。

1.4.5 菌落總數的測定

測定方法按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[14]規定的方法進行。肉樣新鮮度評價參照歐麗娟等[15]和Duun 等[16]的標準：菌落總數＜4.0log（CFU/g）為新鮮肉，在 4.0log（CFU/g）～6.0log（CFU/g）之間為次鮮肉，＞6.0 log（CFU/g）為變質肉。

1.4.6 大腸菌群測定

依據GB4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[17]中第二法大腸菌群平板計數法進行測定。

1.4.7 假單胞菌、乳酸菌、熱死環絲菌及腸桿菌的分離與計數

Russo 等[18]研究得出，熱死環絲菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌是牛肉冷藏過程中生長的優勢菌種，因此本試驗采用這4 種菌進行分離與計數。參照陳銳穎[13]的方法，分別采用相應選擇性培養基進行分離培養并進行平板計數。培養溫度為（30±1）℃，培養時間為48 h。

1.5 數據處理與分析

每個試驗重復3 次，結果表示為平均數值±標準差，圖表采用Sigmaplot13.0 繪制，數據采用SPSS Statistics 20.0 統計分析軟件進行顯著性分析和相關性分析，顯著性水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結果與討論

2.1 冷鮮牛肉貯藏期間感官品質及新鮮度的變化

2.1.1 冷鮮牛肉貯藏期間感官指標的變化

冷鮮牛肉貯藏期間感官指標變化圖1。

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣的感官評分呈逐漸下降的趨勢。以第0 天肉樣感官評分為100為標準，第1 天肉樣感官評分為98，與第0 天時差異不顯著（P＞0.05）；從第3 天開始，肉樣的感官評分呈極顯著下降（P＜0.01），第 5 天時為 61，屬次鮮肉；第 7 天時肉樣的感官評分為42，說明肉樣已腐敗。

2.1.2 冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N 的變化

冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N 變化見圖2。

圖1 冷鮮牛肉貯藏期間感官評分雷達圖Fig.1 Radar map of sensory score of chilled beef during storage

圖2 冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N 值變化Fig.2 Changes in TVB-N of chilled beef during storage

揮發性鹽基氮是牛肉在腐敗過程中，由于細菌分解蛋白質產生的胺類堿性含氮物質。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣的TVB-N 值呈逐漸上升的趨勢（P＜0.05），尤其是第 3 天開始，肉樣的 TVB-N 值呈極顯著增加（P＜0.01）。第 0 天時肉樣的 TVB-N 值為 8.016 mg/100 g；貯藏 1 天后 TVB-N 值增加為8.621 mg/100 g，第 3 天增加為 10.762 mg/100 g；第 5 天肉樣的TVB-N 值達到15.774 mg/100 g，為次鮮肉；肉樣貯藏第7 天時，TVB-N 值超過20 mg/100 g，說明肉樣已腐敗。張婷[19]研究得出自封袋包裝的冷藏牛肉貯藏 2 天后 TVB-N 值接近 15 mg/100 g，5 d 后超標。張鐵華等[20]研究未經包裝的冷鮮牛肉貯藏第5 天時TVBN 值已超過20 mg/100 g，這說明保鮮盒包裝在一定程度上可以延長牛肉的貨架期。

2.1.3 冷鮮牛肉貯藏期間pH 值的變化

冷鮮牛肉貯藏期間pH 值變化見圖3。

圖3 冷鮮牛肉貯藏期間pH 變化Fig.3 Changes in pH of chilled beef during storage

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣pH 值呈逐漸增加的趨勢，且從第3 天開始肉樣的pH 值顯著增加（P＜0.01）。在第 1 天時肉樣的 pH 值為 5.83，與第0 天時差異并不顯著（P＞0.05），說明肉樣非常新鮮；第3 天時肉樣的pH 值增長為5.90，與第1 天相比差異極顯著（P＜0.01），原因是肉樣蛋白質在腐敗菌產生的蛋白酶作用下分解成胺類等堿性物質使pH 值升高，但肉樣仍為鮮肉；第5 天時肉樣的pH 值大于6.00，這與陳銳穎[13]的研究結果是一致的。第7 天時肉樣的pH 值為6.14，仍小于6.20，原因可能是肉樣采用塑料盒加蓋包裝，造成了一定的厭氧環境，使好氧菌生長受到一定的抑制，而乳酸菌等兼性厭氧菌生長繁殖產生一定量的乳酸，使肉樣pH 值升高延緩，這是圖7中得到了證實。

2.1.4 冷鮮牛肉貯藏期間TBARS 值的變化

冷鮮牛肉貯藏期間TBARS 變化見圖4。

圖4 冷鮮牛肉貯藏期間TBARS 值變化Fig.4 Changes in TBARS of chilled beef during storage

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣的TBARS值呈逐漸上升的趨勢。第0 天時肉樣的TBARS 值為0.05 mg/kg，貯藏 1 d 后，該值極顯著升高（P＜0.01），貯藏第7 天時該值達到0.238 mg/kg，仍小于0.5 mg/kg，原因可能是也于肉樣采用塑料盒加蓋包裝有關。

2.1.5 冷鮮牛肉貯藏期間菌落總數的變化

冷鮮牛肉貯藏貯藏期間菌落總數變化見圖5。

圖5 冷鮮牛肉貯藏過程中菌落總數變化Fig.5 Changes in colony count of chilled beef during storage

由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣菌落總數呈逐漸上升的趨勢。第0 天時肉樣菌落總數對數值為4.61，貯藏 1 d 后為 4.73，兩者差異并不顯著（P＞0.05），原因是0 ℃～4 ℃貯藏能有效的抑制菌落總數初期的生長。貯藏3 天時肉樣菌落總數顯著增加（P＜0.05），其對數值達到5.46，說明第3 天是肉樣菌數增長的對數期，即為抑菌的最佳時期。貯藏第3 天至第7 天時肉樣菌落總數仍呈上升趨勢，但增長速度減慢（P＞0.05），說明細菌生長接近穩定期。第5 天時肉樣菌落總數對數值已接近6.0，說明肉樣已為次鮮肉。第7 天時肉樣菌落總數對數值已超過6.0，說明肉樣已腐敗。這與李升升與靳義超[21]研究得出的托盤包裝的冷鮮牛肉的在第9 天時菌落總數對數值仍低于6.0 的結果不一致，可能是原料肉初始菌數及包裝形式不同的原因。

2.1.6 冷鮮牛肉貯藏過程中大腸菌群變化

冷鮮牛肉貯藏過程中大腸菌群變化見圖6。

圖6 冷鮮牛肉貯藏期間大腸菌群變化Fig.6 Changes in the number of coliform of chilled beef during storage

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣大腸菌群數呈逐漸增加的趨勢。貯藏第1 天和第0 天時肉樣大腸菌群數差并不顯著（P＞0.05），原因是低溫條件下貯藏能在短期內有效控制大腸菌群的增長。貯藏3 d后肉樣大腸菌群數顯著增加（P＜0.05），尤其是貯藏第7 天時肉樣大腸菌群數與第5 天時的值差異極顯著（P＜0.01）。

2.1.7 指標間相關性分析

肉樣感官指標及新鮮度指標相關性分析結果見表2。

表2 肉樣指標間的相關性分析Table 2 Correlation analysis among five indexes in specimens

由表2可知，pH 值與TVB-N 值呈極顯著正相關，且均與菌落總數呈顯著正相關，這與李升升與靳義超[21]研究發現的在反映肉新鮮度上，pH 值、TVB-N 與菌落總數相關性大的結果一致，說明三者都能很好的反映肉品的新鮮度。與李飛燕[22]研究得出的保鮮袋包裝冷卻牛肉貯藏期間pH 值與TVB-N 值、菌落總數呈顯著正相關的結論也是一致的。肉樣感官品質評分與pH值、TVB-N 值、菌落總數呈極顯著負相關，原因是pH值、TVB-N 值、菌落總數評價肉樣新鮮度的主要指標，其值越高說明肉樣越不新鮮，則感官評分越低，說明肉品的品質與肉品的新鮮度密切相關，通過測定肉品鮮度指標可反映肉品質；TBARS 值是反應肉樣中脂肪氧化酸敗的指標，其值越高則肉樣越不新鮮，與pH值、TVB-N 值及菌落總數呈顯著相正相關，與感官品質呈顯著負相關，說明TBARS 值也能很好的反應肉品質。

2.2 保鮮盒包裝冷鮮牛肉中菌相的初步分析

2.2.1 冷鮮牛肉中假單胞菌、乳酸菌、熱死環絲菌及腸桿菌的生長變化

冷鮮牛肉貯藏期間假單胞菌、乳酸菌、熱死環絲菌及腸桿菌變化見圖7。

圖7 冷鮮牛肉貯藏期間幾種菌菌數變化Fig.7 Changes in the number of several bacteria of chilled beef during storage

由圖7可知，假單胞菌、乳酸菌在第0 天時菌數對數值分別為4.93 和4.95，顯著高于熱死環絲菌（P＜0.05），說明這兩種菌在牛肉貯藏第0 天時為優勢菌；腸桿菌的菌數對數值為2.15，菌數最低（P＜0.01）。貯藏第1 天到第3 天時假單胞菌、乳酸菌、腸桿菌數呈上升趨勢，而熱死環絲菌菌數無顯著變化（P＞0.05），其中假單胞菌和乳酸菌數仍然顯著高于熱死環絲菌（P＜0.05）和腸桿菌（P＜0.01），說明這兩者菌落還是優勢菌。第5天時熱死環絲菌、假單胞菌和乳酸菌菌數差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于腸桿菌（P＜0.01），以熱死環絲菌數最高。第7 天時，假單胞菌菌數對數值最高為6.04，顯著高于乳酸菌和熱死環絲菌（P＜0.05）及腸桿菌（P＜0.01）。可見在保鮮盒包裝的冷鮮牛肉中主要優勢腐敗菌為假單胞菌，其次為乳酸菌和熱死環絲菌，腸桿菌的菌數相對比較少。

陳銳穎等[13]研究真空包裝牛肉的優勢腐敗菌為乳酸菌和假單胞菌，其次熱死環絲菌和腸桿菌；張鐵華等[20]研究發現無包裝鮮牛肉貯藏過程中G-桿菌為主要菌系，真空包裝鮮牛肉中主要菌系的G+球菌，說明不同包裝形式貯藏的牛肉菌相會有所不同。Xiong[23]研究得出保鮮袋包裝冷卻牛肉中優勢菌為假單胞菌和希瓦氏菌屬，在4 ℃條件下，貨架期為5 d。XU 等[24]研究得出普通包裝和氣調包裝（modified atmosphere packaging，MAP）包裝冷卻牛肉中假單胞菌和熱死環絲菌為優勢菌群。保鮮盒包裝并不是密封包裝，也會有一定的透氧率，嗜冷菌假單胞菌G-桿菌，專性需氧，比較適于生長，為冷鮮牛肉貯藏過程中的優勢腐敗菌[25]；熱死環絲菌為微需氧菌，乳酸菌為兼性厭氧菌，也是主要腐敗菌。

2.2.2 冷鮮牛肉菌相的初步鑒定

菌落形態特征及初步鑒定結果見表3。

表3 菌落形態特征與生化試驗結果Table 3 Colony morphology and biochemical test results

由表3可知，經菌落觀察及生化試驗鑒定4 種選擇性培養基中生長菌分別為假單胞菌屬/乳桿菌、熱死環絲菌及腸桿菌科。

3 結論

保鮮盒包裝冷鮮牛肉貯藏期第1 天時與鮮肉無顯著差異；貯藏第3 天時，肉樣的pH 值、TVB-N 值、TBARS 值以及菌落總數、大腸菌群均顯著增加，但肉樣仍比較新鮮；貯藏第5 天時肉樣為次鮮肉，第7 天時肉樣各項指標均已超標，且感官評分較低，成為腐敗肉。說明保鮮盒包裝冷鮮牛肉在0 ℃～4 ℃條件下貯藏時間需控制在5 d 內，最適貯藏期為3 d。這與程述震[26]結論是一致的。通過指標相關性分析發現，pH 值與TVB-N 值呈極顯著正相關，均與菌落總數呈顯著正相關，說明三者都能很好的反映肉品的新鮮度。肉樣感官品質評分與pH 值、TVB-N 值、菌落總數呈極顯著負相關，說明肉品的品質與肉品的新鮮度密切相關，通過測定肉品鮮度指標可反映肉品質；TBARS 值與pH值、TVB-N 值及菌落總數呈顯著相正相關，與感官品質呈顯著負相關，說明TBARS 值也能很好的反應肉品質。另外，通過初步菌相分析得出，在0 ℃～4 ℃貯藏的條件下，保鮮盒包裝冷鮮牛肉中的優勢腐敗菌有假單胞菌、熱死環絲菌和乳酸菌。本研究為冷鮮牛肉生產企業提供一定的數據指導，也為屠宰過程中牛胴全表面減菌技術及冷鮮牛肉保鮮技術的研究提供一定的理論依據。