響應面優(yōu)化黃槿葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性

陳建福

（漳州職業(yè)技術學院食品工程學院，福建 漳州 363000）

黃槿（Hibiscus tiliaceus），又名公背樹、黃木槿、海麻和桐花等，是錦葵科木槿屬植物，生長在沿海岸或潮水能到達的河岸上[1-2]。黃槿生長速度快、耐熱、耐旱、耐瘠、抗風、耐堿、萌芽強、易移植，適于海岸地帶綠化美化，為海岸防沙、防潮、防風之優(yōu)良樹種，在我國的福建、臺灣、廣西、海南、廣東等沿海省區(qū)均有分布[3]。黃槿的葉、花和樹皮均可入藥，是《全國中草藥匯編》收錄的藥用植物之一。黃槿葉含有黃酮、多糖和多酚等多種天然有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌等活性[4-5]。黃酮是一類廣泛存在于植物體中含有C6-C3-C6基本框架的一類天然產(chǎn)物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、保護心腦血管、抗細菌、抗抑郁及鎮(zhèn)痛等生理活性，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥和保健等領域中[6-8]。本文以漳州產(chǎn)黃槿葉為原料，對其中的總黃酮進行提取，利用響應面法進行優(yōu)化得到了最佳的提取工藝，并考察了總黃酮對DPPH 自由基的清除作用，為黃槿葉總黃酮的工業(yè)化提取奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃槿葉，采于漳州職業(yè)技術學院校內(nèi)，經(jīng)漳州職業(yè)技術學院食品工程學院園藝學專業(yè)王水琦教授鑒定為錦葵科黃槿葉；蘆丁標準品：上海滬宇生物試劑公司；2，6-二叔丁基對苯酚（2，6-di-tert-butyl-pcresol，BHT）：國藥集團上海化學試劑有限公司；抗壞血酸（VC）：西隴化工股份有限公司；其它試劑均為分析純。

UV-7504 型紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；FW-100 高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AR124CN 電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮含量的測定

根據(jù)文獻[9]方法采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，以蘆丁為標準品繪制標準曲線并線性回歸得方程。準確量取一定量提取完后的提取液定容于10 mL 容量瓶中，并按文獻方法測出吸光度，代入回歸方程得出總黃酮質(zhì)量濃度b，通過式（1）計算得總黃酮的提取率。

式中：b 為總黃酮質(zhì)量濃度，mg/L；V 為提取液體積，mL；m 為黃槿葉的質(zhì)量，g。

1.2.2 黃槿葉總黃酮的提取

將采摘的黃槿葉浸泡于蒸餾水，洗凈，自然晾干，并于50 ℃的鼓風干燥箱中干燥，粉碎，取60 目～80 目之間的粉末，備用。稱取1.00 g 的黃槿葉粉末裝入100 mL 的圓底燒瓶中，置于水浴鍋中按提取工藝進行提取，提取結(jié)束后，按1.2.1 計算得總黃酮提取率。

1.2.3 單因素試驗

以乙醇濃度 60%、液料比 30∶1（mL/g）、提取溫度80 ℃和提取時間100 min 為固定水平，考察各單因素對黃槿葉總黃酮提取率的影響，以確定響應面實驗的工藝參數(shù)范圍。各因素分別設置5 個水平，具體為乙醇濃度 40%、50%、60%、70%、80%，液料比 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL/g），提取溫度 70、75、80、85、90 ℃，提取時間 80、90、100、110、120 min，每組試驗重復3 次，取均值。

1.3 響應面設計

通過單因素的試驗結(jié)果對影響黃槿葉總黃酮提取率的乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）4 個因素進行Box-Behnken 試驗設計。具體因素編碼與水平見表1。

表1 Box-Behnken 設計因素與水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度的影響

乙醇濃度對提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration

由圖1可知，當乙醇濃度在40%～60%時，乙醇濃度增大，總黃酮提取率也增大，這是因為乙醇濃度與黃槿葉總黃酮的極性有關，當二者極性接近時，有利于總黃酮溶解到溶劑中，使得提取率增大，但當乙醇濃度過大時，溶劑的極性過小，反而使得總黃酮的提取率下降[10]，因而乙醇濃度選擇為60%。

2.1.2 液料比的影響

液料比對提取率的影響見圖2。

由圖2可知，當液料比在 20∶1（mL/g）～30∶1（mL/g）時，液料比增大，總黃酮提取率也增大，這是因為料液比的增大，增強了溶劑對總黃酮的絕對溶解能力，提高了總黃酮的提取率，但當液料比過大時，溶劑溶解的葉綠素等其它化合物增加[11]，這些物質(zhì)會與總黃酮產(chǎn)生溶出競爭，造成總黃酮提取率的下降，因而液料比選擇為 30∶1（mL/g）。

2.1.3 提取溫度的影響

提取溫度對提取率的影響見圖3。

圖2 液料比的影響Fig.2 Effects of liquid to solid ratio

圖3 提取溫度的影響Fig.3 Effects of extraction temperature

由圖3可知，當提取溫度在70 ℃～80 ℃時，提取溫度升高，總黃酮提取率也增大，這是因為提取溫度的升高，促進了總黃酮分子從黃槿葉顆粒中到溶劑的滲透能力，使得總黃酮的提取率增加，但當提取溫度過高時，黃槿葉總黃酮中的熱不穩(wěn)定性成份容易發(fā)生破壞[12]，造成總黃酮提取率的下降，因而提取溫度選擇為80 ℃。

2.1.4 提取時間的影響

提取時間對提取率的影響見圖4。

由圖4可知，當提取時間在80 min～100 min 時，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率也增大，這是因為提取時間的延長，增加了溶劑與黃槿葉顆粒之間的滲透時間[13]，使得總黃酮提取率增大，但當提取時間過長時，在長時間的提取加熱體系中會有部分總黃酮因氧化而降解，造成總黃酮提取率的下降，因而提取時間選擇為100 min。

圖4 提取時間的影響Fig.4 Effects of extraction time

2.2 Box-Behnken試驗設計與方差分析

2.2.1 響應面試驗

Box-Behnken 試驗設計有24 個析因試驗和5 個中心點試驗共29 個試驗見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken 設計與試驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experiment results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Table of regression model variance analysis

2.2.2 模型的建立與分析

對表2中的Box-Behnken 試驗結(jié)果進行響應面分析，得到黃槿葉總黃酮提取率響應值（Y）與乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）4 個所考察因素的二次多項式回歸模型：

Y=28.29+0.20A+0.07B-0.39C-0.11D-0.30AB-0.16AC-0.29AD+0.69BC+0.49BD+0.81CD-0.81A2-0.75B2-0.97C2-0.82D2

二次多項式回歸模型的方差分析可知，F(xiàn)=10.99，p＜0.000 1，回歸模型極為顯著，說明黃槿葉總黃酮提取率與所考察的工藝因素之間的關系可以利用該回歸方程來正確反映。失擬項p=0.233 6＞0.05，不顯著，表明二次多項式回歸模型與試驗值擬合較好。模型的相關系數(shù)R2為0.916 6，表明試驗值與預測值之間有較好相關性，有91.66%的試驗值能夠利用預測值來解釋。由表3可知，一次項 C，二次項 A2、B2、C2、D2對黃槿葉總黃酮提取率影響達到極顯著水平（p＜0.01），液料比和提取溫度的交互項BC，提取溫度和提取時間的交互項CD 對黃槿葉總黃酮提取率影響極顯著（p＜0.01），其 P 值分為別 0.002 1 和 0.000 5；液料比和提取時間的交互項BD 對黃槿葉總黃酮提取率影響顯著（p＜0.05），一次項 A、B、D，交互項 AB、AC、AD 對黃槿葉總黃酮提取率影響不顯著（p＞0.05），說明所考察的4 個因素乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間與黃槿葉總黃酮提取率之間不是簡單的線性關系。

2.2.3 響應面分析

因素間交互作用對總黃酮提取率的影響見圖5。

通過響應面和等高線圖可以分析所考察的乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）4個工藝因素之間交互作用對總黃酮提取率的影響。如果所考察的兩因素交互作用的響應面坡面較為陡峭，表明該響應值對于交互作用的變動很敏感，交互作用對于響應值影響較為顯著，相反如果響應面坡面較為平緩，則表明響應值對于交互作用的變動影響較小，交互作用對響應值影響較不顯著。從圖5可知，響應面圖曲線最陡的是提取溫度和提取時間交互作用圖，說明所考察的因素中交互作用對黃槿葉總黃酮提取率的影響最為顯著是提取溫度和提取時間，響應面曲線相對較陡的是液料比和提取溫度交互作用圖，說明所考察的因素中交互作用對黃槿葉總黃酮提取率的影響顯著程度次之的是液料比和提取溫度，同理可得，各因素交互作用對黃槿葉總黃酮提取率的影響順序為 CD＞BC＞BD＞AB＞AD＞AC。

圖5 因素間交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of interactions factors on extraction yield of total flavonoids

2.2.4 最優(yōu)化試驗驗證

對回歸模型進行分析得到黃槿葉總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度 64.16%、液料比 27.04∶1（mL/g）、提取溫度76.38 ℃和提取時間93.28 min。在此最佳條件下，預測黃槿葉總黃酮的提取率為28.48 mg/g。為了方便實際的工藝參數(shù)設定，將最佳提取工藝條件修正為乙醇濃度 64 %、液料比 27∶1（mL/g）、提取溫度76 ℃和提取時間93 min，在修正后，進行3 次平行試驗，測得黃槿葉總黃酮提取率為28.35 mg/g，與理論值（28.48 mg/g）相差為0.46%，說明利用該方程對黃槿葉總黃酮的提取率進行優(yōu)化與預測具有較高的準確性和可靠性。

2.3 黃槿葉總黃酮的抗氧化活性

DPPH 自由基清除能力見圖6。

圖6 DPPH 自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging ability

從圖6可知，在10 mg/L～70 mg/L 濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，BHT、VC和黃槿葉總黃酮對DPPH 自由基的清除能力均增強，其IC50分別為44.02、51.72、57.76 mg/L，黃槿葉總黃酮對DPPH 自由基的清除能力低于BHT 及VC，但當濃度大于70 mg/L 后，黃槿葉總黃酮對DPPH 自由基的清除能力開始高于VC，說明黃槿葉總黃酮具有較強的抗氧化活性。

3 結(jié)論

利用Box-Behnken 方法對影響黃槿葉總黃酮提取率的4 個因素進行了響應面設計并進行優(yōu)化，得到了二次多項式回歸模型。黃槿葉總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇濃度 64%、液料比 27∶1（mL/g）、提取溫度76 ℃和提取時間93 min，在該條件下測得黃槿葉總黃酮提取率為28.35 mg/g，與理論值（28.48 mg/g）相差為0.46%，說明利用該方程對黃槿葉總黃酮的提取率進行優(yōu)化與預測具有準確性和可靠性，所提取的黃槿葉總黃酮具有較強的抗氧化活性，對DPPH 自由基的清除能力的IC50為57.76 mg/L。