L-精氨酸對大鼠胃腸激素分泌及食欲的影響

王超，康翠翠，馮江銀，縣怡涵，虞德夫，朱偉云，杭蘇琴

(南京農業大學國家動物消化道國際聯合研究中心，動物科技學院，江蘇 南京210095)

氨基酸是構成蛋白質的基本物質，在生命活動的調節及維持內環境穩態中起重要作用。哺乳動物每天必須攝入一定量的氨基酸來滿足機體需求，飼糧中氨基酸水平的變化會影響動物的食欲及動物生產性能。胃腸道是機體最大的內分泌器官，分布有多種內分泌細胞，包括胃G、D細胞及腸I、K、L細胞等[1]。在這些細胞上分布的營養感應體通過感應日糧中的營養物質，介導胃腸飽感激素分泌，通過腦腸軸調節胃腸道蠕動、胃酸分泌、血糖平衡以及飽腹感等生理反應[2]。

研究表明，鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)作為氨基酸感應體的一員，在人及大鼠的胃腸道內分泌細胞中廣泛表達，不僅參與胃腸道營養素的吸收和代謝，同時可通過感應多種蛋白水解物如L-氨基酸、陽離子多肽等介導胃腸激素分泌而受到廣泛關注[3]。Zhao等[4]報道，CaSR可介導L-色氨酸(L-Trp)刺激豬十二指腸分泌膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP)。Xian等[5]在豬胃上的研究發現，CaSR可介導L-Trp和L-苯丙氨酸(L-Phe)調控胃泌素(gastrin)和生長激素抑制素(somatostatin)分泌。此外，研究還發現，條件性必需氨基酸L-精氨酸(L-Arg)可通過CaSR促進大鼠小腸GIP、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)等胃腸飽感激素分泌[6]。研究表明，這些胃腸飽感激素再通過血液或迷走神經作用于腦部與食欲調節相關的區域，調節下丘腦弓形核上的抑制采食的阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)以及促進采食的神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)等的表達和機體的飽腹感[7]。上述很多研究都在體外進行，條件單一，而體內環境更復雜。因此，進一步研究氨基酸在體內對胃腸激素分泌、胃腸道CaSR基因表達及機體食欲的影響十分必要。Alamshah等[8]通過給小鼠回腸灌注L-Phe發現，小鼠采食量顯著下降，血液中GLP-1和酪酪肽(peptide YY，PYY)的含量顯著升高。當加入CaSR抑制劑后，小鼠采食量恢復正常。該研究表明，小鼠采食量下降可能是L-Phe通過CaSR誘導胃腸激素分泌引起的。Jordi等[9]通過給大鼠分別口服17種氨基酸發現，效果最顯著的3種厭食性氨基酸分別是L-精氨酸、L-賴氨酸和L-谷氨酸。根據前人的研究，我們假設L-Arg可通過CaSR誘導胃腸激素分泌，影響大鼠采食。因此，本試驗以大鼠為研究對象，通過給大鼠灌胃L-Arg，以探究其對大鼠胃腸道CaSR表達、胃腸激素分泌及采食的影響，為氨基酸調控機體采食的機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇體重為180～220 g的2月齡SD(SD大鼠，sprague-dawley rat)雄性大鼠32只。每只大鼠單籠飼養，鼠房溫度20～25℃，保持12 h光照循環;自由采食飲水，提供嚙齒動物標準顆粒料。飼養標準符合我國《實驗動物管理條例》。大鼠及顆粒料均購自南京市青龍山動物繁殖中心。

1.2 試驗設計及樣品采集

1.2.1 試驗I:灌胃不同濃度精氨酸對大鼠采食的影響 試驗于2017年4月在南京農業大學動物實驗基地進行。大鼠在室溫下適應環境及日糧一周后，按照體重相近原則隨機分為4個劑量組，每組8只。L-Arg·HCl低劑量組(5 mmol·kg-1)、中劑量組(10 mmol·kg-1)、高劑量組(20 mmol·kg-1)及對照組(0 mmol·kg-1)。進行灌胃時，左手將大鼠從籠中取出使大鼠呈直立狀，頭部后仰，嘴巴向上張開，右手拿起預先裝有灌胃液的注射器，使灌胃針順著大鼠上頜部向內伸入食道，將灌胃液注入食道使其進入胃部。大鼠灌胃前禁食12 h(6:00-18:00)，每只大鼠灌胃總體積為2.5 m L。灌胃結束后，飼喂預先稱量好的標準顆粒料，記錄并計算灌胃后0～1 h、1～2 h、2～4 h及0～24 h內大鼠的采食量。根據采食量結果篩選出對大鼠采食影響顯著的L-Arg最適劑量，用于大鼠一周灌胃試驗。L-Arg·HCl購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2.2 試驗II:灌胃精氨酸一周對大鼠胃腸激素分泌、CaSR基因表達、采食量及體重的影響 另選30只雄性大鼠適應環境一周，按照體重相近原則隨機分為2組，L-Arg·HCl高劑量組(20 mmol·kg-1)及對照組(0 mmol·kg-1)，灌胃大鼠一周(每天一次)。在此期間，記錄大鼠初始體重、終體重并計算體重變化，每天記錄采食量。一周后眼球靜脈采血，血液凝固后以3500 r·min-1離心10 min取上層血清，-20℃冷凍保存，用于胃泌素(gastrin)、膽囊收縮素(CCK)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)及胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的檢測。采血后脊椎脫臼處死，立即打開腹腔取出胃腸道，根據解剖學區分部分組織，冰上剪取胃、十二指腸、空腸及回腸中段組織，磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)漂去腸內容物;打開頭骨，采集下丘腦，所有組織剪碎置于液氮保存，檢測胃腸道CaSR及下丘腦厭食因子POMC及促食因子NPY(神經肽Y，neuropeptide Y)的基因表達。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 血清胃腸激素含量的測定 嚴格按照大鼠Gastrin、CCK、GIP及GLP-1的試劑盒說明書利用酶標儀(infiniteF50，TECAN，瑞士)檢測大鼠血清中的胃腸激素含量。大鼠Gastrin(型號:ANG-E12225R-1，檢測范圍:2～50 ng·L-1，板內差異＜9%，板間差異＜15%)，CCK(型號:ANG-E11530R-1，檢測范圍:10～200 ng·L-1，板內差異＜9%，板間差異＜15%)，GIP(型號:ANG-E11427R-1，檢測范圍:80～2400 pg·m L-1，板內差異＜9%，板間差異＜15%)，及GLP-1(型號ANG-E11115R-1，檢測范圍:0.2～4.0 pmol·L-1，板內差異＜9%，板間差異＜15%)，試劑盒均購自南京奧青生物技術有限公司。

1.3.2 總RNA的提取、反轉錄及實時熒光定量PCR

根據RNA快速提取試劑盒(RNApure Total RNA Kit，RN03，北京艾德萊生物科技有限公司)說明書提取大鼠胃、十二指腸、空腸、回腸及下丘腦的總RNA，反轉錄體系及反應條件嚴格按照反轉錄試劑盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A，大連寶生物工程有限公司)操作說明進行。

根據參考文獻[10-12]中大鼠CaSR、POMC、NPY以及GAPDH序列合成引物，引物信息見表1。以cDNA為模板，采用SYBR GreenⅡ染料試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM，RR420A，大連寶生物工程有限公司)在Step OnePlus 2.2.2(Life Techhnologies，美國)上進行實時熒光定量PCR。反應體系包括:SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)(2×)10μL，上、下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2μL，dd H2O 6.8μL。PCR反應程序為:95℃預變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40 cycles;95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。每個樣品3個重復，采用2-△△Ct法計算各基因的相對表達量。

表1 相關基因的引物序列Table 1 Primer sequences of related genes

1.4 數據統計分析

采用SPSS 20.0(IBM公司，美國)統計軟件進行統計學分析，各檢測指標結果以平均值±標準誤表示。單因素方差模型One-way ANOVA分析試驗I結果，S-N-K test檢驗差異顯著性;獨立樣本t檢驗分析試驗II結果，F-test檢驗方差同質性。P＜0.05為差異顯著。Pearson模型分析血清中胃腸激素濃度與胃腸道CaSR及下丘腦POMC、NPY基因表達的相關性，相關系數用R表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 灌胃精氨酸對大鼠采食量及體重的影響

從圖1A可以看出，與對照組相比，灌胃10及20 mmol·kg-1L-Arg·HCl后0～1 h內，大鼠的采食量分別下降了46.0% 和60.9%(P＜0.05);在1～2 h及2～4 h內，各組之間無顯著差異;在0～24 h內，分別下降了16.0%和23.1%。說明灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl溶液對大鼠采食量的影響顯著。

根據上述結果，接下來給大鼠灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周，初步探究精氨酸對采食的影響是否長期存在，最終是否影響大鼠體重。結果如圖1B所示，與對照組相比，20 mmol·kg-1L-Arg·HCl顯著降低了大鼠0～1 d和0～2 d的累加采食量(P＜0.05)，0～7 d的采食量有降低的趨勢。大鼠體重變化如圖1C所示，與對照組相比，20 mmol·kg-1L-Arg·HCl顯著降低了大鼠體增重(P＜0.05)。

圖1 灌胃不同濃度精氨酸對大鼠0～24 h內采食量(A)及灌胃精氨酸一周對大鼠采食量(B)和體重(C)的影響Fig.1 Effect of oral gavage of different concentrations of L-Arg·HCl on feed intake of 0-24 h in rats(A)and effect of oral gavage 1 week of 20 mmol·kg-1 L-Arg·HCl on feed intake(B)and body weight(C)in rats

2.2 灌胃精氨酸對大鼠血清胃腸激素的影響

從圖2可以看出，與對照組相比，灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周，血液中CCK的濃度顯著升高(P＜0.05);Gastrin和GIP的濃度有升高的趨勢(P=0.06);而GLP-1的濃度沒有顯著變化。

2.3 灌胃精氨酸對大鼠胃及小腸CaSR表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，灌胃20 mmol·kg-1的L-Arg·HCl顯著提高大鼠胃、十二指腸、空腸及回腸中CaSR的基因表達水平(P＜0.05)。說明，精氨酸可以激活分布于胃及小腸上的CaSR。

2.4 灌胃精氨酸對大鼠下丘腦食欲調節因子基因表達的影響

結果如圖4所示，與對照組相比，灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周后，POMC基因相對表達量顯著升高(P＜0.05)，NPY無顯著差異(P＞0.05)。表明L-Arg可能是通過促進厭食因子的表達，進而下調大鼠采食量。

圖2 灌胃精氨酸對大鼠胃腸激素分泌的影響Fig.2 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on the gut hormone secretion in rats

圖3 灌胃精氨酸對大鼠胃及小腸CaSR表達的影響Fig.3 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on mRNA expression of CaSR in the stomach and small intestine of rats

圖4 灌胃精氨酸對大鼠下丘腦食欲調節因子POMC和NPY基因表達的影響Fig.4 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on mRNA expression of POMC and NPY in the hypothalamic neurons of the rats

2.5 大鼠胃腸激素與胃腸道CaSR及下丘腦POMC和NPY基因表達的相關性分析

由表2可以看出，血清Gastrin濃度與胃中CaSR基因表達量呈顯著正相關(P＜0.05)，與下丘腦食欲調節因子POMC、NPY無顯著相關性(P＞0.05);CCK濃度與十二指腸、空腸CaSR及下丘腦POMC基因表達量呈顯著正相關(P＜0.05);GIP濃度與十二指腸CaSR及下丘腦POMC基因表達量呈顯著正相關(P＜0.05);GLP-1濃度與空腸CaSR及下丘腦POMC基因表達量有正相關的趨勢(0.05＜P＜0.1)。

表2 大鼠血清胃腸激素與胃腸道CaSR及下丘腦POMC和NPY基因表達的相關性分析Table 2 Correlation of the concentration of gut hormone in serum with the gene expression level of CaSR in gastrointestinal tract and POMC,NPY in hypothalamus of rats

3 討論

3.1 灌胃精氨酸對大鼠采食量及體重的影響

蛋白質為動物生長提供了重要的能源物質，然而有研究發現，長期高蛋白飲食會促進機體產生飽腹感并導致體重下降[13]。Veldhorst等[14]研究發現，蛋白質引起的飽腹感主要與其在胃腸道水解產生的氨基酸及小肽有關。Jordi等[9]發現，給大鼠灌胃6.7 mmol·kg-1L-Arg溶液顯著降低了大鼠采食量;Greenwood[15]給小鼠腹腔注射4 mmol·kg-1L-Arg顯著降低小鼠采食量;當給大鼠灌胃4 mmol·kg-1L-Arg溶液，大鼠采食量在0～1 h內有下降的趨勢但不顯著。說明，一定劑量的精氨酸與采食有關。本研究結果顯示，5 mmol·kg-1的L-Arg·HCl溶液對大鼠采食沒有影響，10 mmol·kg-1以上的濃度顯著降低大鼠的采食量，且采食量的降低與L-Arg·HCl的濃度存在線性劑量依賴效應。而且，大鼠在灌胃后1 h采食量下降顯著，在1～2 h和2～4 h內各組間的采食量沒有顯著差異。Alamshah等[8]給大鼠灌胃L-Phe同樣發現，大鼠在0～1 h內采食量下降最顯著。說明氨基酸對采食量的影響可能與胃腸飽感激素對機體采食的調節有關，飽感激素主要在短期內顯著分泌并發揮作用，其濃度可在分泌后幾十分鐘內顯著降低[16]，從而導致采食量在0～1 h下降最顯著。此外，本試驗灌胃一周L-Arg·HCl顯著降低大鼠體增重及0～2 d的累加采食量，0～7 d的累加采食量呈下降趨勢，表明大鼠體增重的減少與采食量的降低有關。Clemmensen等[17]研究發現，給小鼠長期補充L-Arg會減少白色脂肪組織的增加，表明大鼠體增重的減少還可能與白色脂肪組織的減少有關，其具體的影響機制需要進一步的深入研究。

3.2 灌胃精氨酸對大鼠胃腸道CaSR基因表達及胃腸激素分泌的影響

CaSR作為胃腸道重要的氨基酸感應體，在感應蛋白水解物以及介導胃腸激素分泌中起著重要的作用。趙秀英等[18]研究發現降低日糧蛋白水平后，豬小腸CaSR基因表達下降，并伴隨著血清中CCK、GIP、GLP-1等胃腸激素含量的降低。與上述結果相似，本研究結果顯示，大鼠灌胃L-Arg顯著提高了胃和小腸中CaSR基因的表達，促進了Gastrin、CCK和GIP的分泌。有研究報道，CaSR在胃腸道中的G、I、K及L細胞等內分泌細胞中均有表達[3]。本試驗相關性分析發現，胃中CaSR的表達與血液中Gastrin的含量呈顯著正相關，十二指腸和空腸中CaSR表達與CCK的濃度呈顯著正相關，十二指腸CaSR表達與血液中GIP濃度呈顯著正相關，這可能與Gastrin主要由胃竇G細胞分泌，CCK主要由存在于十二指腸和空腸的I細胞分泌，GIP主要由存在于近端小腸的K細胞分泌有關[19]。前期的體外研究結果顯示，當用L-Arg對豬十二指腸進行灌流時，可顯著促進CCK、GIP分泌;然而當加入CaSR抑制劑NPS 2143后，氨基酸引起的激素促分泌作用消失[20]。以上結果說明L-Arg引起的胃腸激素分泌可能是CaSR介導引起的。本試驗還發現，GLP-1的分泌無顯著變化，然而有研究發現，L-Arg可以誘導小鼠體內或離體L細胞GLP-1的分泌[21];另有研究表明，腸道感應營養物質后15～30 min出現GLP-1瞬時分泌高峰，在60～90 min再次達到高峰[22]。本試驗中GLP-1分泌無顯著變化可能是由于本試驗在灌胃后30 min采集血液，因而未檢測到GLP-1的分泌高峰。

3.3 灌胃精氨酸對大鼠下丘腦食欲調節因子的影響

食欲調節系統包括外周及中樞神經系統，下丘腦作為食欲調節中樞在機體采食中起重要調節作用。Sam等[23]報道，內分泌細胞分泌的激素可以通過血腦屏障到達下丘腦，與下丘腦中相關激素受體相結合，傳遞促/厭食信號;或者通過與迷走神經上的激素受體相結合將促/厭食信號傳達至下丘腦弓狀核或腦干，激活攝食相關因子如厭食因子POMC、安非他明調節轉錄因子(cocaine and amphetamine regulated transcript，CART)和促食相關因子NPY及野鼠相關肽(agouti gene-related protein，AgRP)，從而激活室旁核和外側下丘腦區域的腎上腺皮質素受體3和4，調控機體采食量。本試驗對NPY和POMC的基因表達進行檢測，結果發現，厭食因子POMC的表達量顯著升高，NPY沒有顯著變化;且相關性分析表明CCK及GIP的濃度與POMC基因表達量呈顯著正相關。這可能是由于L-Arg刺激飽感激素分泌后，激素與下丘腦激素受體結合或通過與迷走神經激素受體結合后將厭食信號傳遞至下丘腦，下丘腦接收信號后激活厭食因子POMC，從而使POMC基因表達上調。隋嘯一等[24]給家兔飼喂高蛋白日糧發現，十二指腸中CCK及下丘腦弓形核中厭食因子CART和POMC的基因表達顯著升高。Fan等[25]在小鼠上研究發現，CCK可通過調節下丘腦POMC神經元降低小鼠的采食。本研究中胃腸激素CCK顯著分泌，伴隨著POMC表達量的顯著升高，與以上研究結果一致，進一步說明飽感激素CCK與下丘腦厭食因子POMC存在一定關系。然而飽感激素與下丘腦食欲調節因子之間的直接關系尚需進一步驗證。有研究表明，NPY作為促進食欲調節的重要神經元，其表達量會隨著機體對能量需求的增強而升高[26]，在本試驗中大鼠可隨時獲取食物，沒有產生明顯饑餓感，這可能導致了灌胃精氨酸沒有顯著影響大鼠NPY基因的表達。

4 結論

灌胃20 mmol·kg-1L-Arg顯著降低了大鼠采食量及體增重，促進CCK等胃腸激素的分泌，提高了胃和小腸中CaSR及下丘腦厭食因子POMC的基因表達。相關性分析結果表明，灌胃L-Arg后，大鼠血液中Gastrin濃度與胃中CaSR基因表達呈顯著正相關，CCK濃度與十二指腸、空腸CaSR、下丘腦POMC基因表達呈顯著正相關，GIP濃度與十二指腸CaSR和下丘腦POMC基因表達呈顯著正相關。