燕麥與苜蓿不同比例組合對驢盲腸體外發酵的影響

梁婷玉，郞俠，吳建平，*，王彩蓮，劉立山，張瑞，韋勝

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070;2.甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所，甘肅 蘭州730070)

驢(Equus asinus)作為單胃草食動物，具有耐粗飼、抗逆性強等特性。我國養驢數在世界居首位，但目前國內尚沒有專門飼養驢的營養標準，一般都根據小馬營養需要量的75%來飼喂[1]。而相比于馬，驢有更強的粗纖維消化能力，當按馬的日糧配比飼喂驢時會出現一系列健康問題[2]。驢胃容積小，飼料在胃中停留時間短，是易飽又容易餓的動物，需采食大量低能量飼草來滿足食欲，飼草中的纖維素能刺激胃腸蠕動進而促進營養物質的消化吸收。因此在驢的飼養管理中應結合其消化特性和生理需求供給充足的牧草。苜蓿(Medicago sativa)由于營養全面，蛋白含量高(20%以上)等特性，是草食家畜優質牧草之一[3]。研究發現，飼喂苜蓿干草可明顯提高小馬盲腸細菌總數，纖維分解菌的數目也顯著增加，從而有利于纖維素降解[4-5]。在實踐生產中，苜蓿不能單獨飼喂家畜，其纖維含量低，缺乏可溶性碳水化合物，從而降低胃腸道微生物發酵[6]。研究表明，以秸稈等低質飼草作為家畜基礎日糧時，苜蓿可作為理想補充料，可為瘤胃分解菌提供生長所必需的揮發性支鏈脂肪酸[7-8]。燕麥(Avena sativa)是僅次于小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)等糧食作物種植面積居世界第7的農作物，是我國唯一達到干草級的禾本科牧草。晾曬后的燕麥干草適口性好，養分含量高，中性洗滌纖維消化率高，且含有較多的水溶性碳水化合物，可為家畜提供充足的能量。研究發現燕麥干草代替部分苜蓿可改善斷奶后犢牛瘤胃發酵，提高氮利用率，減少腹瀉發生率[9]。

驢的盲腸有著與反芻動物瘤胃類似的作用，是纖維素被大量微生物發酵、分解、消化的地方[10]。Pearson等[11]研究發現飼喂稻草日糧時驢的表觀消化率與牛相似。但飼喂任何單一牧草都不會使盲腸發酵達到優化，本研究通過體外發酵法來研究苜蓿與燕麥組合對驢盲腸降解率及其發酵參數組合效應的影響，為驢養殖業中飼草的科學利用提供數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用燕麥干草和苜蓿干草均采自甘肅省會寧縣世民種養殖有限公司。飼草樣品風干后粉碎，過0.425 mm，再在105℃下烘干至恒重后密封備用。飼草營養成分見表1。

1.2 盲腸液采集與處理

在甘肅省會寧縣世民種養殖有限公司選2頭3～4周歲、體重相近的成年驢作為盲腸液供體動物，屠宰后分離內臟，每頭驢快速采集1.5 L盲腸液，用4層紗布過濾，裝入提前預熱至39℃的保溫瓶中，同時持續注入CO2氣體，快速帶回實驗室進行體外發酵試驗。

表1 2種飼草常規營養成分(干物質基礎)Table 1 Nutrient components of 2 kinds of forage grass(%DM basis)

1.3 試驗設計

本試驗以燕麥和苜蓿為發酵底物進行體外發酵，將燕麥與苜蓿按80∶20，60∶40，40∶60和20∶80進行組合，依次為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，各處理組設5個培養時間點，即2、4、8、12和24 h，每組每個培養時間點設3個重復，測定各培養時間點的產氣量、發酵參數及養分降解率。

1.4 盲腸液體外發酵試驗

1.4.1 人工唾液配制 參照Menke[12]的方法配制人工唾液。其主要成分包含5部分(表2):微量元素溶液(A)、碳酸鹽緩沖液(B)、常量元素溶液(C)、還原劑溶液(D)(現用現配)和指示劑(E)。在發酵試驗開始前將各組分按以下比例混合配制緩沖液:依次加入蒸餾水400 m L、B液200 m L、C液200 m L、A液0.1 m L、D液40 m L和E液1 m L。在39℃恒溫水浴鍋中預熱，并在充分混勻后持續通入CO2氣體，直至溶液顏色由粉紅色變為無色即可。

表2 人工唾液配方Table 2 The formula of artificial saliva

1.4.2 體外發酵及樣品采集 體外產氣裝置采用ANKOM RFS產氣系統。準確稱取按相應比例混合的飼草0.5 g裝入250 m L厭氧發酵瓶底部，迅速向每個瓶中加入100 m L預熱的液體培養基和50 m L經4層紗布過濾的盲腸液，并向瓶中持續通入CO25 s，立即蓋上瓶塞，將每個發酵瓶與產氣裝置中相應的傳感器相連接，于39℃下連續培養24 h。發酵過程中實時記錄每小時的產氣量(gas production，GP)。

發酵參數及養分降解率用人工瘤胃系統進行發酵。準確稱取按相應比例混合的飼草0.5 g裝入尼龍袋中，每組15個重復，在105℃下烘干至恒重后將4個處理組尼龍袋分別裝入1、2、3、4號發酵罐，再向每個發酵罐中加入1000 m L緩沖液和500 m L經4層紗布過濾的盲腸液，并持續通入CO2氣體10 s，蓋上瓶蓋放入人工瘤胃裝置中進行發酵，在發酵過程中分別采集2、4、8、12和24 h時每組的發酵液45 m L分裝于15 m L離心管-20℃保存待測，同時每組取3個尼龍袋，用自來水沖洗終止發酵，用于營養物質消化率測定。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 常規營養成分分析及降解率測定 參考袁纓[13]的《動物營養學實驗教程》檢測燕麥和苜蓿干物質(dry matter，DM)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗蛋白(crude protein，CP)、粗灰分(crude ash，Ash)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、鈣(calcium，Ca)和磷(phosphorus，P)含量，計算燕麥與苜蓿不同比例組合DM、NDF和ADF體外降解率。其中:

某養分降解率=[(試驗原料中某養分含量-發酵濾渣中某養分含量)/試驗原料中某養分含量]×100%

1.5.2 發酵參數測定 1)p H及GP測定:采用p H5系列筆式p H計直接測定2、4、8、12、24 h時培養液的p H值。讀取發酵2、4、8、12和24 h時的累積壓力值，某時間點的累積產氣量按下列公式計算:

Vx=Vj×Ppsi×0.068004084

式中:Vx為39℃下某時間點的產氣體積(m L);Vj為發酵瓶內液面上部空間的體積(m L);Ppsi為軟件記錄的累積壓力psi。

2)NH3-N、VFA及MCP濃度的測定:采用馮宗慈等[14]的方法測定培養液NH3-N濃度;采用GC-2010島津氣相色譜儀測定揮發性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)含量;培養液中菌體蛋白(microbial protein，MCP)含量采用南京建成蛋白定量測試盒(A045-2)檢測，即考馬斯亮藍法。

3)飼草組合效應的估算:

單組合效應指數(single-factor associative effects index，SFAEI)=(實測值-加權估算值)/加權估算值×100%

多項組合效應綜合指數(multiple-factors associative effects index，MFAEI)=∑SFAEI=

SFAEIGP+SFAEIMCP+SFAEINH3-N+SFAEITVFA

式中:實測值為實際測定值;加權估算值=燕麥實測值×燕麥比例(%)+苜蓿實測值×苜蓿比例(%)。

1.6 數據統計分析

用Excel 2013整理后，用SPSS 21.0軟件進行單因子方差分析，對營養物質降解率和發酵參數等數據用Duncan’s法進行多重比較，結果用平均值±標準誤(Mean±SE)表示，當P＜0.05時認為差異顯著;對組合效應值進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 飼草組合發酵液p H的變化

由表3可知，隨著發酵時間的延長，各組p H均逐漸降低。在發酵2 h時，Ⅰ組p H最高，且顯著高于Ⅳ組(P＜0.05);8 h時Ⅲ、Ⅳ組p H均顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P＜0.05)，12 h時Ⅳ組p H顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P＜0.05);24 h時Ⅳ組p H顯著高于其余3組(P＜0.05)。

表3 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵p H的影響Table 3 Effect of different proportions of forages on the p H of in vitro fermentation of donkey cecum

2.2 飼草不同比例組合對驢盲腸體外DM、NDF和ADF降解率的影響

由表4可知，隨著發酵時間的延長，DM降解率逐漸增加。Ⅳ組各時間點DM降解率最高，發酵4 h時，Ⅳ組顯著高于其余3組(P＜0.05)，12 h時Ⅳ組顯著高于Ⅱ組(P＜0.05)，24 h時Ⅳ組顯著高于Ⅰ組，其余各組間無顯著性差異(P＞0.05)。

表4 飼草不同比例組合對驢盲腸體外DM消失率的影響Table 4 Effect of different proportions of forages on DM of in vitro fermentation of donkey cecum(%)

由表5可知，隨著發酵時間的延長，NDF降解率逐漸增加，發酵2 h時Ⅰ、Ⅱ兩組NDF降解率均顯著高于Ⅲ和Ⅳ組(P＜0.05)，從發酵8 h開始，Ⅳ組各時間點NDF降解率高于其他各組，但差異不顯著(P＞0.05)。

表5 飼草不同比例組合對盲腸體外NDF消化率的影響Table 5 Effect of different proportions of forages on NDF of in vitro fermentation of donkey cecum(%)

由表6可知，隨著發酵時間的延長，ADF降解率逐漸增加，發酵2 h時，各組間無顯著性差異(P＞0.05);發酵4、8和12 h時，Ⅳ組ADF降解率顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(P＜0.05);發酵24 h時Ⅳ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，其余各組間無顯著性差異(P＞0.05)。

表6 飼草不同比例組合對驢盲腸體外ADF降解率的影響Table 6 Effect of different proportions of forages on ADF of in vitro fermentation of donkey cecum(%)

2.3 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵產氣量(GP)的影響

由表7可知，各組產氣量均隨發酵時間的延長而不斷增加，各時間點GP均為Ⅱ組顯著高于其余3組(P＜0.05)，各組24 h GP由高到低依次為Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅲ，其中Ⅰ、Ⅲ組總產氣量顯著低于Ⅱ和Ⅳ組(P＜0.05)。

表7 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵GP的影響Table 7 Effect of different proportions of forages on gas production of in vitro fermentation of donkey cecum(m L)

2.4 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵NH 3-N濃度的影響

由表8可知，燕麥與苜蓿不同比例組合對驢盲腸體外發酵液中NH3-N濃度有顯著影響。發酵2 h時，Ⅱ組NH3-N濃度顯著高于其余3組(P＜0.05)，4 h時Ⅰ組顯著高于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組(P＜0.05)，12和24 h時Ⅲ和Ⅳ組NH3-N濃度均顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05)。

表8 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵NH3-N濃度的影響Table 8 Effect of different proportions of forages on NH3-N concentration of in vitro fermentation of donkey cecum(mg·100 mL-1)

2.5 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵MCP濃度的影響

由表9可知，隨著發酵時間的延長，MCP濃度呈先降低再升高再降低的變化趨勢，發酵2 h時Ⅳ組MCP濃度顯著低于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組(P＜0.05)，12 h時Ⅲ、Ⅳ組MCP濃度顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05)，24 h時Ⅱ組MCP濃度顯著高于Ⅲ組(P＜0.05)，與Ⅰ、Ⅳ組間差異不顯著(P＞0.05)。

表9 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵MCP濃度的影響Table 9 Effect of different proportions of forages on MCP concentration of in vitro fermentation of donkey cecum(mg·mL-1)

2.6 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵VFA的影響

燕麥與苜蓿不同比例組合對體外發酵液中VFA有較大影響(表10)。乙酸濃度在發酵2～12 h內，Ⅱ組均顯著高于其他3組(P＜0.05)，24 h時Ⅰ、Ⅱ組間無顯著性差異(P＞0.05)，但均顯著高于Ⅲ和Ⅳ組(P＜0.05)，且Ⅳ組顯著高于Ⅲ組(P＜0.05);丙酸濃度在發酵2 h時Ⅱ組顯著高于其他3組(P＜0.05)，4、8和12 h時Ⅰ、Ⅱ組間均無顯著性差異(P＞0.05)，且在8和12 h時Ⅰ、Ⅱ組丙酸濃度均顯著高于Ⅳ組(P＜0.05)，24 h時Ⅰ、Ⅳ組均顯著高于Ⅱ和Ⅲ組;各組異丁酸濃度在各時間點均存在顯著性差異，且Ⅱ組最高，在4、8和12 h時Ⅱ組顯著高于其他3組(P＜0.05)，24 h時與Ⅰ組無顯著性差異(P＞0.05);丁酸濃度在各發酵時間點均為Ⅱ組顯著高于其他3組(P＜0.05)，24 h時Ⅰ組顯著高于Ⅲ和Ⅳ組(P＜0.05);異戊酸濃度除發酵8 h時各組間差異不顯著外(P＞0.05)，其他各時間點均為Ⅱ組顯著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組(P＜0.05);戊酸濃度分別在2、4和12 h時Ⅱ組顯著高于Ⅲ和Ⅳ組(P＜0.05)，其余時間點各組間無顯著性差異(P＞0.05);發酵2～12 h內各時間點總揮發性脂肪酸(TVFA)含量均是Ⅱ組顯著高于Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ組(P＜0.05)，24 h時Ⅰ、Ⅱ組間無顯著性差異(P＞0.05)，但均顯著高于Ⅲ和Ⅳ組，且Ⅲ組顯著低于Ⅳ組(P＜0.05)。

表10 飼草不同比例組合對驢盲腸體外發酵VFA影響Table 10 Effect of different proportions of forages on VFA production of in vitro fermentation of donkey cecum(mmol·L-1)

2.7 飼草組合效應

由表11可知，單項組合效應值(SFAEI)中Ⅱ組的GP、TVFA和MCP效應值最高，Ⅳ組的NH3-N濃度效應值最高。但通過多項組合效應值(MFAEI)綜合評估來看，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組均為正組合效應，且Ⅳ組組合效應值最高，Ⅲ組為負組合效應。

表11 燕麥與苜蓿組合效應綜合評價Table 11 Comprehensive evaluation of combined effects of oat and alfalfa

3 討論

3.1 燕麥與苜蓿不同比例組合對盲腸體外發酵液p H的影響

p H是維持盲腸內環境正常的重要指標之一，也是評價盲腸發酵的基本指標。p H的變化直接影響盲腸微生物對纖維類物質的降解[15]。細菌、原蟲和厭氧性真菌最適生存p H分別為6.7、5.8和7.5[16]。本試驗測得發酵液的p H為6.71～6.80，在盲腸微生物活動的適宜范圍內，各比例組合的發酵環境穩定。試驗結果顯示在發酵2 h時隨苜蓿含量的增加p H逐漸降低，從12 h開始，p H逐漸趨于穩定。有研究表明日糧中蛋白含量的增加可顯著影響微生物發酵進而降低p H，但隨著發酵時間的延長，發酵體系逐漸趨于穩定，p H逐漸趨于正常水平[17]，本試驗結果與此一致。

3.2 燕麥與苜蓿不同比例組合對DM、NDF和ADF體外降解率的影響

日糧中DM的降解率是評價飼料被動物可利用程度的重要指標，一般DM降解率越高飼料的可利用程度越高[18]。NDF和ADF是粗飼料纖維物質的主要組成部分，具有調控微生物發酵作用[19]。本研究發現各組DM、NDF和ADF降解率隨著發酵時間的延長，均呈不同程度的上升趨勢，該結果與劉艷芳等[20]的研究結果一致。燕麥與苜蓿不同比例組合對NDF降解率無顯著影響，對ADF降解率影響較為顯著，但隨著苜蓿比例增加DM、NDF和ADF降解率均有所升高。趙紅艷[21]通過苜蓿與其他秸稈類飼草組合得出了相似結果。由于適宜的纖維含量會提高飼料利用率，但纖維含量過高會降低飼料利用率[22]。

3.3 燕麥與苜蓿不同比例組合對驢盲腸體外發酵產氣量的影響

體外發酵產氣量是衡量飼料可消化性的重要指標[23]。Silva等[24]發現不同粗飼料間組合可能會出現飼料間的正組合效應，改善劣質飼料的降解率，繼而提高產氣量。本試驗結果表明，Ⅱ組各時間點累計產氣量均為最高，Ⅱ和Ⅳ組產氣量組合效應優于Ⅰ和Ⅲ組;此外Ⅱ組產氣量顯著高于Ⅳ組，該結果與湯少勛等[25]研究結果相似。有學者認為產氣量的增加表明微生物發酵活性越強，則飼料消化率會不斷提高[12，26]。但由于不同飼料的產氣量并不相同，故產氣量的多少并不能直接來評價飼料的降解程度，需要與其他指標相結合進行評價[27]。

3.4 燕麥與苜蓿不同比例組合對驢盲腸體外發酵NH 3-N和MCP濃度的影響

NH3-N濃度可反映日糧中蛋白的降解及MCP合成狀況。有研究表明，瘤胃中NH3-N濃度為8.5 mg·100 m L-1時瘤胃微生物蛋白質合成能力將達到飽和[28]。本研究結果表明，發酵液中NH3-N濃度為2.73～5.94 mg·100 m L-1，且隨著發酵時間的延長，發酵液中NH3-N濃度呈降低趨勢，但隨著苜蓿比例的增加，NH3-N濃度隨發酵時間的延長而逐漸趨于穩定，Ⅱ組NH3-N濃度從2 h時的最高到24 h時降至最低，由此推斷Ⅱ組微生物對NH3-N的利用較高。本試驗所得NH3-N濃度與趙紅艷[21]研究結果相比偏低，可能是由于本試驗以單純的粗飼料為發酵底物而使可降解碳水化合物偏少，進而使微生物活性受限所致[29]。有研究報道體外培養中滿足微生物生長需要的理想NH3-N濃度為2～5 mg·100 m L-1[30]，因此本研究結果在正常范圍內。MCP的代謝程度決定了消化道微生物區系的營養代謝水平[31]。MCP也反映飼料組合為微生物提供可利用蛋白質的能力，主要受飼料中可降解氮和可發酵能平衡程度的影響[32]。本研究結果顯示在發酵12 h時苜蓿比例較高的Ⅲ和Ⅳ組MCP濃度較苜蓿比例低的Ⅰ和Ⅱ組高，但在24 h時Ⅱ組顯著高于Ⅲ組，該結果與張銳等[33]的研究結果一致。

3.5 燕麥與苜蓿不同比例組合對驢盲腸體外發酵VFA的影響

飼糧經消化道微生物發酵所產生的乙酸、丙酸、丁酸等VFA是草食家畜主要的能量來源[34]。乙酸、丙酸和丁酸占消化道發酵TVFA的95%，其中乙酸是動物體合成乳脂肪和體脂肪的原料，丙酸主要是促進葡萄糖的轉化與儲存，丁酸可為動物機體供能[35]。試驗中，燕麥與苜蓿不同比例組合對各種VFA及TVFA均有顯著影響，其中在發酵24 h時，除丙酸外，Ⅱ組其余各種脂肪酸含量均顯著高于其他3組;相比于苜蓿含量高的Ⅲ和Ⅳ組，Ⅰ和Ⅱ組TVFA含量顯著提高。飼糧中可降解纖維含量的升高可提高發酵液中VFA的濃度，進而為消化道微生物生長繁殖提供充足能量[36-37]。

3.6 燕麥與苜蓿組合效應的綜合評估

家畜采食混合飼料是絕對的，各營養素通過飼料間的相互作用和影響作用于家畜。Ewing等[38]將混合日糧中不同組分之間的相互影響定義為飼料組合效應。家畜品種、飼養水平、飼草料種類及配合比例等因素均可直接促使飼草料之間組合效應的發生[26]。單個飼料的營養價值及利用率會隨著日糧結構和采食量等因素的不同而改變。本試驗結果顯示，燕麥與苜蓿不同比例組合，Ⅰ、Ⅱ兩組SFAEI中24 h總產氣量和TVFA為正，Ⅲ和Ⅳ組為負，且Ⅱ組大于Ⅳ組。從產氣量、NH3-N、TVFA和MCP 4個指標綜合分析發現Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組MFAEI均為正，且Ⅳ組MFAEI值最大，Ⅲ組MFAEI為負。

4 結論

燕麥與苜蓿按20∶80組合時能提高DM、NDF和ADF降解率，且多項組合效應值更高;燕麥與苜蓿飼喂驢以20∶80組合效果較好。