混合質控菌種盲樣的鑒定分析

□ 張春鵬 徐州市質量技術監督綜合檢驗檢測中心

1 引言

微生物盲樣考核是對檢測人員技能、實驗室質量控制和管理水平的檢驗，實驗室專業技術人員必須考慮實驗室的設備、培養基、試劑、診斷血清等因素，從接種、培養、分離鑒定等環節進行嚴格的質量控制，減少主觀因素對檢驗結果的影響，進而保證檢驗結果的準確性。在實驗評審過程中，特別是現場評審中，盲樣測試方式可以更直接地反映被評審實驗室的儀器設備和技術素質的實際水平[1]。

2 材料與方法

2.1 微生物盲樣樣品

樣品為來自CMA評審專家提供的半固體1支，盲樣編號為MY-WJ-01。盲樣中有兩種或以上菌株，且為食品檢測中常見的致病菌，要求最終報告得出的結果是所有檢出菌種的名稱。

2.2 培養基及試劑

培養基和細菌生化鑒定管，廣東環凱微生物科技有限公司；沙門氏菌診斷血清（60種），寧波天潤生物藥業有限公司；標準菌株，中國工業微生物菌種保藏管理中心；以上試劑均在有效期內。

2.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-4），北京市永光明醫療儀器有限公司；生化培養箱（SPX-300BSH-II），上海新苗醫療器械制造有限公司；厭氧培養箱（DG250），英國DWS；顯微鏡（BX41），奧林巴斯；全自動微生物生化鑒定儀（VITEK2）并配套革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌鑒定卡，法國梅里埃；以上所有儀器設備檢定均在有限期內。

2.4 檢測方法

食品衛生微生物學檢驗標準GB 4789及CMA評審專家提供的《致病菌檢測作業指導書》。

3 結果與分析

3.1 增菌培養

挑取質控樣接種到腦心浸出液肉湯（BHI）培養基中，接種兩瓶，分別放在生化培養箱和厭氧培養箱中以36℃培養24h，結果為兩瓶增菌液均混濁。

表1 在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

表2 在三糖鐵斜面上的生長情況和革蘭氏染色結果

3.2 劃線分離

用接種環從增菌液中挑取1環直接劃線接種到BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色瓊脂平板、MAC瓊脂平板、TCBS瓊脂平板、血瓊脂平板、Barid-Parker瓊脂平板、哥倫比亞CNA血瓊脂平板、MYP瓊脂平板、PALCAM瓊脂平板、李斯特氏菌顯色瓊脂平板、CT-SMAC瓊脂平板、大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板、阪崎腸桿菌顯色瓊脂平板、CN瓊脂平板，觀察菌落特征。在BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色瓊脂平板、血瓊脂平板和Barid-Parker瓊脂平板中發現2種不同的可疑菌落，分別編為1號菌和2號菌，菌落特征見表1。

3.3 生化試驗 [2]

挑取上述平板中的典型菌落接種到三糖鐵瓊脂斜面上，置36℃培養24h，觀察生化特征并涂片染色，結果見表2。

1號菌繼續做其它相關生化試驗，結果符合沙門氏菌菌屬，結果見表3。然后，經血清鑒定為鼠傷寒沙門氏菌（1,4,[5],12:i:1,2）。

3.4 血漿凝固酶試驗[3]

挑取Baird-Parker平板上的可疑菌落，接種到5mL BHI中，36℃±1℃培養18～24h。取新鮮配制兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養物0.2～0.3mL，置于36℃±1℃培養，每半小時觀察一次，觀察6h，同時作陰性對照實驗。結果發現，培養物小試管中呈現凝塊，陰性對照未出現凝塊，因此可判定結果為陽性，故2號菌可判定為金黃色葡萄球菌。

3.5 全自動微生物生化鑒定

從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成0.5MCF濁度的菌懸液，1號菌和2號菌分別使用革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌鑒定卡，置于VITEK2全自動微生物鑒定系統進行分析，結果分別顯示為沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

表3 1號菌生化試驗結果

綜合以上細菌菌落特征、菌體染色形態、生化試驗、血清學和全自動生化鑒定結果，可判斷該盲樣樣品中檢出2種菌，即鼠傷寒沙門氏菌（1,4,[5],12:i:1,2）和金黃色葡萄球菌。

4 結論與討論

實驗室在收到樣品后，首先要對盲樣樣品狀態進行確認，如出現包裝破損或其他異常情況應及時與實施部門聯系，這是做好質控盲樣的前提[4]。準備檢測前，應仔細閱讀《作業指導書》，盡可能制定全面的檢測方案。在分析鑒定過程中，應選擇多種分離增菌液和選擇性瓊脂平板，并在選擇性平板上盡可能挑取各種典型菌落[5]，以避免漏檢。為做好混合菌種質控的鑒定分析工作，可采用常規生化試驗與全自動微生物生化鑒定儀相結合的方式[6]，進而保證對菌種的結果判定更為準確、快捷。

本次混合菌種鑒定項目取得了令人滿意的實驗結果。盲樣考核是開展CMA/CNAS認證評審的重要內容，利用盲樣測試進行現場評審能直接反映出實驗室的儀器設備和技術素質的實際水平和出具報告的能力[7]，其不僅是衡量實驗室技術能力的關鍵指標，還有利于檢測機構重視檢驗水平的提升，不斷提高專業技術人員的技能水平，確保檢測結果的準確性。