液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞蛋中磺胺類藥物

□ 倫麗麗 江蘇美正生物科技有限公司

磺胺類藥物（SAs）是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類化學(xué)藥物的總稱，被廣泛用于畜禽生產(chǎn)中以防治細(xì)菌感染。在養(yǎng)殖密度較大的家禽行業(yè)中，使用磺胺類藥物防治細(xì)菌感染的做法尤為普遍，因此禽蛋中存在著磺胺類藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，我國相關(guān)的動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的檢測(cè)方法已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)雞蛋中儀器檢測(cè)的報(bào)道文獻(xiàn)較少。本文建立了雞蛋中16種磺胺類藥物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，其靈敏度高、穩(wěn)定性好，能夠滿足對(duì)雞蛋中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與耗材

磺胺乙酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺吡啶、磺胺地索辛、磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲基異噁唑、苯甲酰磺胺、磺胺喹惡啉、磺胺鄰苯甲氧嘧啶，德國DR.E公司。

乙腈、甲醇、甲酸等，均為色譜純（國藥）。

將標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成單標(biāo)母液，并配制10μg/mL混合儲(chǔ)備液于-20℃保存，使用時(shí)現(xiàn)配為系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

雞蛋購于超市，經(jīng)液質(zhì)分析確認(rèn)均為陰性樣本。

1.2 儀器設(shè)備

ACQUITYTM型超高效液相色 譜 儀、Waters Xevo TQS四 極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）， 美國Waters公司；離心機(jī)；純水儀；氮吹儀。

1.3 試驗(yàn)

1.3.1 前處理方法優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、1%甲酸乙腈作為提取溶劑，對(duì)事先添加25μg/kg混標(biāo)溶液的空白雞蛋樣本進(jìn)行提取，并進(jìn)行提取溶劑優(yōu)化試驗(yàn)；比較了渦旋振蕩提取、渦旋振蕩+超聲配合提取，對(duì)事先添加25μg/kg混標(biāo)溶液的空白雞蛋樣本進(jìn)行萃取，同時(shí)進(jìn)行提取方法優(yōu)化試驗(yàn)；比較了10g無水硫酸鈉加入與否對(duì)結(jié)果的影響；最終確定最優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

1.3.2 優(yōu)化后的前處理方法

稱取樣品2g，加入混合內(nèi)標(biāo)工作液100ng、無水硫酸鈉10g、12mL1%甲酸乙腈，渦旋振蕩2min，超聲提取10min；7000rpm離心5min，取上清，60℃水浴氮吹至干。然后，加入5mL正己烷進(jìn)行凈化，并加入2mL初始流動(dòng)相進(jìn)行復(fù)溶，棄去上層液體，取下層溶液0.22μm濾膜待上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 液相條件

色 譜 柱：A cquity UPLC BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)； 流動(dòng)相A：2mmol乙酸銨-0.1%甲酸；流動(dòng)相B：乙腈。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

表2 16種磺胺類藥物的檢測(cè)離子、質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離子模式：ES+；毛細(xì)管電壓：1.2kV；萃取錐孔電壓：60V；RF透鏡電壓：50V；離子源溫：600℃；脫溶劑溫度：600℃；錐孔氣流速：150L/h；脫溶劑氣流速：1000L/h；碰撞氣流速：0.15mL/min；采集模式：MRM；各種藥物優(yōu)化母離子和子離子及對(duì)應(yīng)聚焦電壓和碰撞電壓值見表2。

1.3.5 定量測(cè)定

圖1 不同提取溶劑對(duì)磺胺類藥物回收率的影響

圖2 不同提取方法對(duì)磺胺類藥物回收率的影響

按照儀器的色譜條件和質(zhì)譜條件，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及樣品液等體積進(jìn)樣測(cè)定，磺胺二甲異惡唑、磺胺喹惡啉和磺胺間二甲氧嘧啶以氘代磺胺間二甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)；磺胺二甲異嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺間甲氧嗜啶、磺胺甲氧噠嗪、碳胺甲惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、碳胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺氯噠嗪以氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)；磺胺氯吡嗪采用外標(biāo)法定量。

1.3.6 方法線性和靈敏度試驗(yàn)

試驗(yàn)采用空白雞蛋樣品，經(jīng)1.3.2方法處理，在1.0～50μg/kg濃度范圍內(nèi)分別添加不同梯度磺胺類藥物混標(biāo)溶液，分別配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/kg基質(zhì)加標(biāo)溶液，通過檢測(cè)峰面積繪制峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)將處理好的空白雞蛋樣品逐級(jí)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.7 方法的回收率試驗(yàn)

試驗(yàn)選取空白雞蛋樣品，分別添加濃度為2.0、10.0、25.0μg/kg低、中、高3個(gè)水平混標(biāo)溶液，每個(gè)濃度做6個(gè)平行，按照1.2.2方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，通過測(cè)定回收率和RSD來評(píng)估方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

結(jié)果表明，以1%甲酸乙腈為提取液時(shí)，除了磺胺氯吡嗪外的其他15種磺胺類藥物的回收率與乙腈作為提取劑的回收率均有所提高，結(jié)果見圖1。

2.2 提取方法的選擇

試驗(yàn)結(jié)果表明，將渦旋振蕩提取與超聲提取結(jié)合的提取方法，其回收率明顯優(yōu)于單純的渦旋振蕩提取法，結(jié)果見圖2。

2.3 凈化劑對(duì)結(jié)果的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，加入凈化劑后，提取液外觀更為澄清，回收率更好，結(jié)果見圖3。試驗(yàn)最終選擇10g無水硫酸鈉作為凈化劑。

2.4 線性方程及靈敏度試驗(yàn)

圖3 是否加入凈化劑對(duì)磺胺類藥物回收率的影響

表3 雞蛋中16種磺胺類藥物的線性關(guān)系

結(jié)果表明，1.0～50μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；將處理好的空白雞蛋樣品逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照10倍信噪比確定方法的LOQ；為了便于配置混標(biāo)溶液且在滿足檢測(cè)要求的前提下，將16種藥物的定量限定于2.0μg/kg，結(jié)果見表3。

表4 方法的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.5 回收率和精密度試驗(yàn)

從表4可以看出，16種磺胺類藥物的回收率在75.53%～125.23%，RSD在0.08%～14.98%，說明本方法準(zhǔn)確度、精密度均能滿足雞蛋中磺胺類藥物的檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

檢測(cè)準(zhǔn)確性是對(duì)儀器檢測(cè)方法的第一需求，而前處理方法是儀器檢測(cè)方法中較為復(fù)雜且非常重要的環(huán)節(jié)。本文通過對(duì)提取劑、提取方法、凈化與否的優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)雞蛋中16種磺胺UPLC-MS-MS的檢測(cè)方法。

本方法的樣品經(jīng)過振蕩和超聲混合提取、加入凈化劑凈化，提取率高、凈化效果好，并以超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、回收率均保持在比較滿意的水平，能夠滿足同時(shí)檢測(cè)雞蛋中多種磺胺類藥物殘留的要求，為制定禽蛋中磺胺類藥物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)參考。