枸杞丹參對視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)及CRYAB mRNA的影響

劉家琪　王英　蔣鵬飛　潘坤　徐劍　彭俊　彭清華

[摘要] 目的 觀察枸杞加丹參對視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)以及αB多肽（CRYAB）mRNA的影響。方法 將24只雌雄不拘的視網(wǎng)膜色素變性RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組及杞參組，每組8只，雌雄各4只。另RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8只，雌雄各4只，為空白組。常規(guī)喂養(yǎng)1周后開始灌胃，1次/d。空白組與模型組給予生理鹽水，杞參組給予成人等效劑量的枸杞+丹參。連續(xù)灌胃30 d后處死，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組RCS大鼠視網(wǎng)膜的外核層厚度等形態(tài)學(xué)改變，采用qPCR檢測RCS大鼠視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達。 結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：空白組各層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)排列整齊有序，形態(tài)規(guī)則;模型組較空白組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)排列明顯疏松、變性萎縮，外核層厚度明顯變薄，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;而杞參組雖與空白組比較結(jié)構(gòu)較紊亂，厚度變薄，但較模型組厚度增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。qPCR結(jié)果顯示：空白組大鼠在視網(wǎng)膜中可見CRYAB mRNA的表達，模型組大鼠視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達較空白組明顯降低（P < 0.01），杞參組大鼠視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達較模型組升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 RCS大鼠能很好地模擬人視網(wǎng)膜色素變性的發(fā)病特點，其視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂變性，外核層變薄，視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達被抑制，而枸杞+丹參能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達，對視網(wǎng)膜色素變性RCS大鼠的視網(wǎng)膜有一定的保護作用。

[關(guān)鍵詞] 視網(wǎng)膜色素變性;枸杞;丹參;CRYAB mRNA

[中圖分類號] R774.1 ? ? ? ? ?[文獻標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（b）-0013-04

[Abstract] Objective To observe the effects of Lycium barbarum and Salvia miltiorrhiza on the morphology of retinal tissue and alpha B-crystalline （CRYAB） mRNA in rats with retinitis pigmentosa. Methods Twenty-four male and female retinitis pigmentosa RCS （rdy-/-， p-/-） rats were divided into a model group and a ginseng group according to random number table method， with 8 rats in each group， 4 males and 4 females. Another 8 RCS （rdy+/+， p+/+） rats， 4 males and 4 females， were blank group. Oral gavage was started 1 week after routine feeding， once a day. The blank group and the model group were given normal saline， and the ginseng group was given an equivalent dose of Lycium barbarum + Salvia miltiorrhiza. The rats were sacrificed for 30 days after continuous gavage. The morphological changes of the outer nuclear layer of the retina of each group were observed under light microscope. The expression of CRYAB mRNA in RCS rats was detected by qPCR. Results The results of HE staining showed that the retinal structure of each layer in the blank group was neatly arranged and regular in shape. The retinal structure of the model group was looser， with degeneration and atrophy， and the thickness of the outer nuclear layer was significantly thinner， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the blank group， the ginseng group had a disordered structure and thinner thickness， but it had increased thickness compared with the model group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The results of qPCR showed that the expression of CRYAB mRNA was observed in the retina of rats in the blank group. The expression of CRYAB mRNA in the retina of the model group was significantly decreased compared with the blank group （P < 0.01）. The expression of CRYAB mRNA in the retina of the ginseng group was higher than that in the model group and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion RCS rats can well simulate the pathogenesis of human retinitis pigmentosa. The structure of the retina is disordered， the outer nuclear layer is thinned， the expression of CRYAB mRNA in the retina is inhibited， and Lycium barbarum + Salvia miltiorrhiza can induce the expression of CRYAB mRNA in the retina. It has a certain protective effect on the retina of retinitis pigmentosa RCS rats.

[Key words] Retinitis pigmentosa; Lycium barbarum; Salvia miltiorrhiza; CRYAB mRNA

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一組常見的以原發(fā)性光感受器及色素上皮功能喪失為特點的遺傳特異性眼病[1-2]。病因?qū)W和流行病學(xué)資料顯示，患病人數(shù)呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，是視網(wǎng)膜病主要的致盲眼病[3-4]。

大多數(shù)學(xué)者認為RP的發(fā)病部位在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層[5]，近年來又有研究者發(fā)現(xiàn)，RP最初病變位于視網(wǎng)膜色素上皮層[6]。RP的最終病理機制為細胞凋亡，αB多肽（alpha B-crystalline，CRYAB）能抑制介導(dǎo)細胞凋亡的p53、Caspase-3的激活，在保護視網(wǎng)膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）、光感受器細胞免受損傷的過程中發(fā)揮了重要作用[7]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品

RCS大鼠24只，其中RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8只，RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠16只，1.5月齡，雌雄各半，體重75～130 g，SPF級，全部動物由昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供，質(zhì)量合格證號：201614068，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。枸杞、丹參中藥配方顆粒，每袋相當(dāng)于臨床使用量飲片10 g，生產(chǎn)廠家為廣東一方制藥有限公司。

1.2 分組與給藥

將16只RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組及杞參組，每組8只，雌雄各4只。另RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8只為空白組，雌雄各4只。

常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始灌胃。連續(xù)灌胃30 d，1次/d，灌胃量如下：空白組及模型組生理鹽水12 mL/kg，杞參組用生理鹽水配制枸杞加丹參中藥配方顆粒的混合溶液。所有動物給藥劑量按“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算，折算公式：W×成人用量（mg）/動物體重（kg），其中折算系數(shù)W=0.018，成人用量參照2015年版《中華人民共和國藥典》。

1.3 取材

取材時相為灌胃30 d結(jié)束后。1%苯巴比妥鈉3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，摘除雙眼球。每組選取1只眼球，保存于4%多聚甲醛溶液中，行常規(guī)病理切片檢測。其余眼球保存于-80℃超低溫冰箱中備用，供RT-qPCR檢測CRYAB。

1.4 HE染色

4%多聚甲醛溶液中取出標(biāo)本，酒精梯度脫水，二甲苯溶液浸泡，石蠟浸蠟，常規(guī)包埋，切片機切片，常規(guī)HE染色，封片固定。在光學(xué)顯微鏡下觀察各標(biāo)本視網(wǎng)膜色素上皮層、光感受器細胞層、內(nèi)核層等各層結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)改變;隨機選取3個視野，用數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)測量視網(wǎng)膜外核層細胞的厚度。

1.5 qPCR檢測視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達

設(shè)計引物，從NCBI中搜索并下載CRYAB目的基因序列，引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件，設(shè)計的引物由上海生工合成，具體引物序列如下：CRYAB-F為5′-CTCCAGGGTCCCCGTGGTA-3′，CRYAB-R為5′-AGGAGAGGCCAGCACCAC-3′，β-actin-F為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，β-actin-R為5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。提取總RNA，測RNA濃度與純度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進行PCR檢測，94℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s后延伸10 min，電泳結(jié)果使用Bio-Rad自帶軟件Image Lab分析得到目的條帶與內(nèi)參條帶的光密度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0系統(tǒng)軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，滿足方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法檢驗，若方差不齊時，采用非參數(shù)秩和檢驗。計數(shù)資料采用完全隨機設(shè)計多樣本比較的秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RCS大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變

空白組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列整齊有序，形態(tài)規(guī)則（圖1A）。模型組RCS大鼠視網(wǎng)膜外層結(jié)構(gòu)紊亂，光感受器細胞數(shù)量減少、厚度變薄（圖1B）。杞參組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)尚規(guī)則，視網(wǎng)膜厚度較模型組增加（圖1C）。

2.2 各組RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層的厚度

模型組較空白組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度明顯變薄，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。杞參組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度低于空白組大鼠，但較模型組RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠視網(wǎng)膜厚度增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.3 各組RCS大鼠視網(wǎng)膜上CRYAB mRNA表達情況比較

模型組CRYAB mRNA表達明顯低于空白組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。杞參組CRYAB mRNA表達低于空白組，高于模型組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

3 討論

RCS大鼠是視網(wǎng)膜色素變性的經(jīng)典動物模型[8]，自出生后2周起，視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)生變性壞死，視錐、視桿細胞核逐漸萎縮，數(shù)量減少[9]。生長至3月齡時大部分視錐、視桿細胞消失，形成空泡[10]。RCS大鼠的RPE細胞存在一種基因突變，使RPE細胞不能吞噬脫落的膜盤，從而導(dǎo)致了病變的發(fā)生[11]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種突變存在于受體酪氨酸酶的Mertek基因[12]。這一基因位于染色體2q14，1[13]，其突變也存在于人類RP中。CRYAB是α-晶體蛋白的一條基因編碼，CRYAB除了存在于晶體，在視網(wǎng)膜、視神經(jīng)以及心、腦等眼外組織中均有表達[14]。Alge等[15]研究發(fā)現(xiàn)CRYAB通過抑制介導(dǎo)細胞凋亡的Caspase-3的自身蛋白質(zhì)水解激活，可以延緩RPE細胞的變性死亡。Mehlen等[16]還發(fā)現(xiàn)CRYAB可抑制或下調(diào)凋亡受體（如FAS/APO-1），減緩細胞凋亡進而保護細胞存活。

RP屬于中醫(yī)學(xué)“高風(fēng)內(nèi)障”的范疇，《證治準(zhǔn)繩·七竅門》《目經(jīng)大成·陰風(fēng)障》等書中均有RP的描述。歷代醫(yī)家大都認為其基本病機為“虛證”，然彭清華教授在長期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)RP的病機大多為虛中夾瘀，瘀始終貫穿在RP的發(fā)生發(fā)展過程，前期研究表明，枸杞加丹參較單味藥枸杞、丹參能明顯降低RP動物的血漿黏度、纖維蛋白原，減少視網(wǎng)膜的損傷因素（P < 0.05）[17-20]。

本研究中采用RCS大鼠作為實驗鼠，觀察了枸杞+丹參對RCS大鼠視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的影響以及視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果表明：①選擇RCS大鼠作為RP的動物模型，能很好地模擬人RP的發(fā)病特點;②RP大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂變性，外核層變薄，視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達被抑制;③枸杞+丹參能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜CRYAB mRNA的表達，對RP大鼠的視網(wǎng)膜有一定的保護作用。

[參考文獻]

[1] ?Jones BW，Pfeiffer RL，F(xiàn)errell WD，et al. Retinal remodeling in human retinitis pigmentosa [J]. Exp Eye Res，2016， 150（2）：149-165.

[2] ?Pawlyk BS，Bulgakov OV，Sun X，et al. Photoreceptor rescue by an abbreviated human RPGR gene in a murine model of X-linked retinitis pigmentosa [J]. Gene Ther，2016， 23（2）：196.

[3] ?董玉萍，王磊峰，董秋艷，等.視網(wǎng)膜色素變性的流行病學(xué)調(diào)查[J].武警醫(yī)學(xué)，2015，26（9）：950-952.

[4] ?Marchena M，Villarejo-Zori B，Zaldivar-Diez J，et al. Small molecules targeting glycogen synthase kinase 3 as potential drug candidates for the treatment of retinitis pigmentosa [J]. J Enzyme Inhib Med Chem，2017，32（1）：522-526.

[5] ?劉家琦，李鳳鳴.實用眼科學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：451-453.