抗寒苜蓿品系生產性能評價及ISSR遺傳多樣性分析

魏雙霞，師尚禮，康文娟，譚諶淼

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

苜蓿具有產量高，粗蛋白含量高，適口性好的特點，在世界范圍內廣泛種植[1-2]。青藏高原素有 “世界屋脊"和 “世界第三極"之稱[3]，是我國重要的草地畜牧業基地之一，但過度放牧使天然草地產量下降，毒雜草滋生，牧草品質降低[4]，造成嚴重的經濟損失。解決這一問題，需要了解紫花苜蓿對寒冷地區的適應性特征和規律。因此，深入研究苜蓿的生產性能和遺傳基礎，選育出適應于該地區種植的苜蓿新品系，擴大其種植范圍，提高生產力，具有舉足輕重的意義。

目前，我國關于苜蓿品種適應性評價的研究主要在干旱半干旱地區，朱博等[5]、王虹等[6]通過綜合評價篩選出在西北荒漠地區種植的高產優質苜蓿品種。而對苜蓿品種在高寒地區適應性的研究很少，其中丁培俊等[7]在甘南州進行了苜蓿引種品比試驗，挑選出適宜于青藏高原種植的傳統苜蓿材料金皇后和阿爾岡金。楊瞾等[8]在東北寒冷地區對引種的 16個苜蓿材料應用灰色關聯度進行生產性能評價，篩選出適應性較好的品種有俄羅斯西伯利亞雜花等。采用3份抗寒苜蓿品系和3份對照苜蓿材料，進行生長適應性對比試驗，綜合評價生產性能，以期為高寒牧區培育多年生抗寒苜蓿新品系，發展苜蓿產業提供技術依據。

分子標記是以DNA多態性為基礎的遺傳標記，在苜蓿生物技術育種和種質資源評價中的地位不可忽視[9]。李哲等[10]用ISSR在遺傳距離0.266處將供試苜蓿材料聚為5大類，為其后代株系雜交組合育種的研究提供理論支持。楊瞾等[11]用 ISSR在遺傳距離0.833處將供試抗旱苜蓿材料分為高產、優質和營養價值相對較低2大類。應用ISSR分子標記方法研究3份抗寒苜蓿品系和3份對照苜蓿材料俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后、阿爾岡金之間的親緣關系遠近和遺傳多樣性，確定不同品系之間的遺傳差異及遺傳背景，為驗育種工作提供分子水平的理論依據和技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗于2013年4月～2015年5月在高寒濕潤氣候區的甘南州夏河縣牧草試驗站進行。夏河縣位于甘南藏族自治州西北部，E 101°54′～103°25′，N 34°32′～35°34′，地處青藏高原東北邊緣，地勢由西北向東南傾斜，海拔3 000～3 800 m，屬于寒冷濕潤性氣候，土壤類型為高寒草甸土，有明顯的腐殖質積聚，腐殖質層厚10 cm，呈灰棕至黑褐色粒狀-扁核狀結構，土壤有機質含量45 140 mg/kg，pH 7.87，速效氮50.83 mg/kg，速效磷10.57 mg/kg，速效鉀230.0 mg/kg，土壤肥力均勻。

1.2 試驗材料

供試材料GNKH-1(Cold resistance No.1 of alfalfa)、GNKH-2(Cold resistance No.2 of alfalfa)和GNKH-3(Cold resistance No.3 of alfalfa 3)為甘肅農業大學草業學院選育的3個抗寒苜蓿新品系，具有較強的抗寒能力和優質高產性能。對照材料為抗寒能力強的俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿(M.sativasubsp.varia)(FD.2)、金皇后苜蓿(M.sativacv.Golden Empress)(FD.3)和阿爾岡金紫花苜蓿(M.sativacv.Algonguin)(FD.3)，均由甘肅農業大學草業生態系統教育部重點實驗室提供(表1)。

表1 供試苜蓿材料

1.3 試驗設計

田間試驗采用隨機區組設計，小區面積3 m×5 m，3次重復，采用深開溝，淺覆土，冬前耙平的播種技術：人工開溝條播，溝深12～15 cm，覆土1～2 cm，冬前耙平埋頸，行距30 cm，播量1.7 g/m2。適時對試驗地進行鋤草及病蟲害防治等田間管理。

于2013年12月在實驗室內沙培種植，放置于光照充足、溫度適宜的組織培養室內，期間定期定量加入Hogland營養液。待出苗后30 d采集各供試苜蓿材料幼嫩葉片提取DNA待用。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 生產性能 (1) 物候期特征比較 對每個品種生長第1年和第2年的出苗期(返青期)、分枝期、現蕾期、初花期進行觀測記錄。苜蓿品種每小區留2行進行物候期觀測，鑒別的標準是50%的植株達到某一個生育階段為某生育期；10%～20%的植株達到為初期，70%～80%達到為盛期[18]。

(2) 越冬率 采用隨機取樣法進行調查，避開邊緣地段，在小區株行內隨機選取長為1 m的樣段，調查每一樣段內的株數。翌年植物返青后調查原樣段內返青的株數，然后計數返青后存活的株數和越冬前總株數，用下式計算越冬率。

(3) 干鮮比和干草產量 干鮮比測產時，每個小區稱鮮草500 g，自然風干后稱重，計算干鮮比，干鮮比=苜蓿風干重/苜蓿鮮重；干草產量 在每茬初花期，每小區隨機取樣1 m2，重復3次，刈割后稱重量，留茬高度3～5 cm，取平均值為鮮草產量，根據干鮮比計算干草產量。青藏高原高寒濕潤氣候區2013年刈割1茬，2014年刈割2茬，年度產量為各茬草產量之和。

(4) 株高和生長速度 株高 在第1茬初花期測產前，每個小區隨機選取10株，測量植株絕對高度(拉直測定)；生長速度 第1茬草從分枝期開始，每個小區隨機選取10個單株，做好標記，直到初花期測定生長高度，兩次生長高度之差除以生長天數即為生長速度。

(5)分枝數和葉莖比 分枝數 魏臻武等[35]的方法，每年第1茬初花期測定地表根莖部形成的分枝數。

葉莖比 測產時，取500 g全株鮮草將莖葉分離，稱量葉片和莖稈鮮重，105℃殺青15 min，并置于65℃下烘至恒重，冷卻后取出用1%天平稱量葉片和莖稈干重。

1.4.2 遺傳特征 (1) DNA提取 每份材料隨機取10個單株的幼嫩葉片0.5 g，洗凈葉片后等量混合，采用柱式植物基因組抽提試劑盒提取苜蓿總DNA。

(2) DNA檢測 在濃度2.0%的瓊脂糖凝膠上對提取的DNA進行電泳，于紫外凝膠成像儀中拍照；用紫外分光光度計于D260 nm與D280 nm檢測所提取的DNA濃度。

(3) 引物合成與篩選 試驗初期選擇了10條引物，由上海生工有限公司合成。經引物篩選試驗，篩選了PCR擴增效果好、條帶清晰的8條引物用于6份苜蓿的遺傳多樣性研究。

(4)ISSR擴增與檢測 采用25 μLPCR反應體系，模板DNA 2 μL、ISSR合成引物1 μL，DreamTaqGreen PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水9.5 μL。擴增條件為預變性94℃ 4 min，然后循環，94 ℃ 1 min，45～60℃ 40 s，72℃ 1～2 min，共40輪循環。循環結束后，72℃ 10 min，最后在4℃條件下保存。取PCR產物7 μL于1.6%的瓊脂糖膠上電泳，在0.5×TBE緩沖液中電泳約1.5 h，在紫外凝膠成像儀中拍照。

1.5 數據處理和評價方法

1.5.1 生產性能評價 用SPSS 19.0統計軟件和EXCEL進行數據處理及分析；應用主成分分析法對多個指標進行綜合評判。先把參與主成分分析的n個指標變量進行標準化，計算出特征值和貢獻率以及主成分，最后比較總得分值F的大小，F值越大表明該苜蓿材料生產性能適應性越強。

1.5.2 遺傳特征分析 對強帶以及清晰可辨的弱帶進行統計賦值，采取0/1賦值的記帶方法，即有帶計為“1”，無帶計為“0”，從而實現PCR擴增產物的條帶總數和多態性條帶數的統計。

多態性位點比率：p=i/j×100%

式中：i為多態性位點的數目，j為統計出的總位點數目。

使用軟件Ntsys-pc 2.1軟件進行分析，計算 Nei’s遺傳距離，使用UPMGA法進行聚類分析，建立聚類圖。使用軟件 POPGEN 32計算ISSR擴增產物多態信息含量。

2 結果與分析

2.1 生物學特性及生產性能比較

2.1.1 物候期比較 高寒濕潤氣候區各苜蓿材料物候期差異很大，各苜蓿材料于2013年5月17日播種，5月25日出苗，截止6月1日齊苗，7月初開始分枝，抗寒苜蓿品系分枝期比對照苜蓿品種早10 d。播種第1年，GNKH-2和GNKH-3出苗期最早，比對照材料提前5～10 d；GNKH-3、GNKH-2有現蕾并有開花，但開花數不足10%，其他品種均只生長到分枝期。播種第2年，3個抗寒苜蓿品系返青、分枝、現蕾、開花、結莢、枯黃各物候期時間較為一致，對照品種俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后和阿爾岡金各物候期時間較為一致，但GNKH-3和GNKH-2較其他材料提前5 d進入現蕾期。播種第2年，各品種均能結莢，種子均未成熟(表1)。

表2 高寒濕潤氣候區供試苜蓿材料的物候期

2.1.2 生產性能指標特征分析 播種當年，供試苜蓿材料均能安全越冬，但越冬率較低，苜蓿材料平均越冬率為60.32%，其中GNKH-3和GNKH-2的越冬率最高，達到了76.66%，72.34%，顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，GNKH-1次之，阿爾岡金最低(40.39%)。播種的第2年，供試苜蓿材料的越冬率均超過90%，顯著高于播種當年的越冬率(P<0.05)，GNKH-3的越冬率也最高，為94.43%，顯著高于對照苜蓿俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿(P<0.05)，GNKH-2次之，為93.21%。GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1兩年的平均越冬率分別為85.55%、82.78%、78.99%，均高于對照(圖1)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤氣候區的越冬率表現，GNKH-3為適宜高寒濕潤氣候區的越冬率最高的苜蓿材料，GNKH-2和GNKH-1為高寒濕潤氣候區越冬率較高的苜蓿材料。

圖1 越冬率Fig.1 Wintering rate

供試苜蓿材料干鮮比隨著生長年限的增加均呈減小趨勢。播種當年平均干鮮比為0.28，其中阿爾岡金干鮮比最高(0.29)，俄羅斯西伯利亞雜花最低(0.26)。播種第2年，供試苜蓿材料的干鮮比均為0.25，其中GNKH-2干鮮比最高，為0.27，顯著高于俄羅斯西伯利亞雜花和阿爾岡金(P<0.05)，俄羅斯西伯利亞雜花也最低(0.23)。GNKH-2、GNKH-1兩年的平均干鮮比分別為0.27、0.27，均高于對照(圖2)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤氣候區的干鮮比表現，GNKH-2為適宜高寒濕潤氣候區的干鮮比最高的苜蓿材料，GNKH-1為高寒濕潤氣候區干鮮比較高的苜蓿材料。

圖2 干鮮比Fig.2 Ratio of dry to fresh mater

播種當年，供試苜蓿材料由于生育期沒有達到初花期，干草產量較低，隨著生長年限的增加，不同苜蓿材料的干草產量均呈增加趨勢。播種當年平均干草產量為2.20 t/hm2，其中GNKH-2干草產量最高，為2.95 t/hm2，顯著高于對照俄羅斯雜花和金皇后(P<0.05)，GNKH-1和GNKH-3次之，分別為2.77、2.67 t/hm2，俄羅斯西伯利亞雜花最低，為1.38 t/hm2。播種第2年，抗寒苜蓿材料的干草產量顯著高于播種當年(P<0.05)，對照苜蓿材料的干草產量相對于播種當年有所增加，但是不顯著。供試苜蓿材料的干草產量平均為5.15 t/hm2，其中GNKH-3干草產量最高，為8.81 t/hm2，顯著高于GNKH-1和對照苜蓿材料(P<0.05)，GNKH-2和GNKH-1次之，也顯著高于對照苜蓿材料(P<0.05)，金皇后最低(1.94 t/hm2)。GNKH-3，GNKH-2和GNKH-1兩年的平均干草產量分別為5.74、5.49和4.94 t/hm2，均高于對照(圖3)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤氣候區的干草產量表現，GNKH-3為適宜高寒濕潤氣候區的干草產量最高的苜蓿材料，GNKH-2和GNKH-1為高寒濕潤氣候區干草產量較高的苜蓿材料。

圖3 干草產量Fig.3 Hay yield

(3) 株高和生長速度 播種當年，供試苜蓿材料的平均株高為48.10 cm，其中GNKH-3、GNKH-2株高最高，分別為53.45 cm、52.42 cm，顯著高于對照材料俄羅斯西伯利亞雜花和金皇后(P<0.05)，金皇后最低(41.33 cm)。播種第2年，供試苜蓿材料的株高顯著高于播種當年(P<0.05)，平均株高為64.66 cm，其中GNKH-3株高最高，為70.62 cm，顯著高于對照苜蓿材料(P<0.05)，GNKH-2、GNKH-1次之，為68.32、65.57 cm，均高于對照材料(57.49～64.21 cm)。GNKH-3，GNKH-2和GNKH-1兩年的平均株高分別為62.03，60.37和58.56 cm，均高于對照(圖4)。

供試苜蓿材料在高寒濕潤氣候區生長緩慢，生長速度低，播種當年只能收獲1茬，第2年只能收獲2茬。播種當年，供試苜蓿材料的生長速度平均值為0.65 cm/d，其中GNKH-3、GNKH-2生長速度顯著高于對照俄羅斯雜花和金皇后(P<0.05)，分別為0.74、0.73 cm/d，GNKH-1次之，為0.70 cm/d，金皇后最低(0.55 cm/d)。播種第2年，供試苜蓿材料的平均生長速度為0.77 cm/d，供試苜蓿材料的生長速度有所增加，其中GNKH-3、GNKH-2生長速度也顯著高于對照俄羅斯雜花和金皇后，分別為0.86、0.83 cm/d，GNKH-1次之，為0.82 cm/d，金皇后最低(0.66 cm/d)。GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1兩年的平均生長速度分別為0.80，0.78和0.76 cm/d，均高于對照(圖5)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤氣候區的株高和生長速度表現，GNKH-3為高寒濕潤氣候區的株高和生長速度最高的苜蓿材料，GNKH-2和GNKH-1為高寒濕潤氣候區株高和生長速度均較高的苜蓿材料。

圖4 株高Fig.4 Plant height

圖5 生長速度Fig.5 Growth rate

(4) 分枝數和葉莖比 播種當年，供試苜蓿材料的分枝數平均為11.0個/株，其中GNKH-2分枝數顯著高于俄羅斯雜花和金皇后(P<0.05)，為12.7個/株、GNKH-1、GNKH-3次之，分別為12.2、12.1個/株，金皇后最少(8.7個/株)。播種第2年，供試苜蓿材料的平均分枝數為14.3個/株，抗寒苜蓿材料的分枝數顯著高于播種當年(P<0.05)，對照苜蓿材料的分枝數相對播種當年也有所增加，其中GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1分枝數顯著多于對照苜蓿材料(P<0.05)，分別為18.5，17.8和17.1個/株。GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1兩年的平均分枝數分別為15.3，15.2和14.7個/株，均高于對照(圖6)。

播種當年，供試苜蓿材料的葉莖比平均為1.11，其中GNKH-3，GNKH-2和GNKH-1葉莖比均比對照多，分別為1.15，1.14和1.13，金皇后最小(1.01)，顯著低于其他苜蓿材料(P<0.05)。播種第2年，供試苜蓿材料的葉莖比顯著低于播種當年(P<0.05)，平均葉莖比為0.84，其中GNKH-3，GNKH-1和GNKH-2葉莖比均大于對照苜蓿材料，分別為0.89，0.88和0.86。GNKH-3，GNKH-1和GNKH-2兩年的平均葉莖比分別為1.02，1.01和1.00，均高于對照(圖7)。

圖6 分枝數Fig.6 Branching number

綜合分析供試苜蓿材料在兩個氣候區的分枝數和葉莖比表現，GNKH-3為高寒濕潤氣候區的分枝數和葉莖比最高的苜蓿材料，GNKH-1、GNKH-2為高寒濕潤氣候區的分枝數和葉莖比較好的苜蓿材料。

圖7 葉莖比Fig.7 Leaf to stem ratio

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 DNA 檢測 分子標記是以DNA多態性為基礎的遺傳標記，在苜蓿生物技術育種和種質資源評價中的地位不可忽視。因此，在苜蓿常規育種的基礎上，結合分子標記輔助育種，進行種質資源評價，可為我國苜蓿種質資源的科學利用和育種工作提供更為可靠的技術支持。簡單重復序列間擴增分子標記技術能夠更好的檢測出生物遺傳物質的多態性，因此，在遺傳上有遠景[13]，ISSR標記為顯性標記，可以揭示整個基因組的一些特征，符合孟德爾遺傳規律，具有穩定性好，多態性高，試驗操作簡單、快速、用時少等優點，該技術被廣泛用作研究植物種質資源遺傳多樣性及親緣關系的有效手段[14-15]。

挑選每個材料條帶清晰、無降解、無拖尾現象的DNA樣品進行檢測。6 份參試材料DNA條帶清晰，點樣孔干凈，表明DNA片段大小比較均一，純度比較高，總DNA稍帶乳白色，在D260 nm及D280 nm處的D值為 1.80～1.88，濃度2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果比較理想，能夠達到ISSR分子標記分析的要求(圖8)。

圖8 6份苜蓿材料的DNA檢測Fig.8 DNA testing chart of 6 alfalfa materials注：從左到右依次為M，GNKH-1，GNKH-2，GNKH-3，俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿，金皇后苜蓿，阿爾岡金苜蓿

2.2.2 PCR 擴增產物多態性 用通過引物篩選試驗得到的8條多態性好的引物，對6份苜蓿材料進行擴增，并對擴增圖譜進行統計分析。結果表明8個引物共擴增出87條清晰譜帶，平均每個引物能擴增出10.9個條帶，平均多態性比率(PPB)為62.07%。不同引物擴增出來的片段數不同，除了引物844和847的條帶較少，分別為7個和9個；引物822，845和888的條帶數均大于10個，他們的擴增產物多態性最豐富，圖譜也很清晰，并且擴增產物的多態性比率均在80%，多態性信息含量較高。其他3個引物825，855和885的條帶數也均大于10個，他們的擴增產物多態性也較豐富，圖譜也清晰。6份材料的有效等位基因數為1.494 3、基因多樣性指數為0.2676和Shannon’s信息指數為0.3842(表3)。

2.2.3 遺傳相似性系數分析 6份材料間的遺傳相似性系數在0.482 8～0.954 0，GNKH-1和GNKH-2的遺傳相似性最大，為0.954 0，GNKH-1與親本阿爾岡金的遺傳相似性為0.517 2；GNKH-3與阿爾岡金間的遺傳相似性最小，為0.482 8，說明它們在親緣關系上離得最遠，GNKH-3與親本金皇后的遺傳相似性為0.551 7；與GNKH-3遺傳相似性最高的是俄羅斯西伯利亞雜花，為0.6667。3個抗寒苜蓿品系與對照材料的遺傳相似性都比較小，為0.482 8～0.666 7，表明抗寒苜蓿品系與對照材料的親緣關系相對較遠，具有相對獨立的遺傳特性。整體分析，6份苜蓿材料間遺傳異質性豐富(表4)。

表3 ISSR分析所用引物序列和擴增結果

圖9 引物822，845和888 ISSR擴增Fig.9 Amplification map of 822,845,888 ISSR注：從左到右依次為M，GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3，俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿，金皇后苜蓿，阿爾岡金苜蓿

2.2.4 ISSR遺傳多樣性分析 利用ISSR遺傳相似性系數矩陣，根據UPGMA法進行聚類分析，構建了6份參試苜蓿材料的親緣關系系統樹狀圖。在遺傳距離0.78處，6份苜蓿材料被分為2個大類，第1個大類包括了GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3抗寒苜蓿品系，第2大類包括俄羅斯西伯利亞雜花，金皇后和阿爾岡金。在遺傳距離0.86處，6份苜蓿材料被分為3個大類，第1個大類包括了GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3抗寒苜蓿品系，第2大類包括俄羅斯西伯利亞雜花和金皇后，第3大類只有阿爾岡金。在遺傳距離0.88處，6份苜蓿材料被分為4個大類，第1個大類包括了GNKH-1、GNKH-2、GNKH-3 抗寒苜蓿品系，第2大類只有俄羅斯西伯利亞雜花，第3大類只有金皇后，第4大類只有阿爾岡金。在遺傳距離0.90處，GNKH-3單獨聚類(圖10)。

表4 6份苜蓿材料遺傳相似系數矩陣

圖10 6份苜蓿材料基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類Fig.10 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 6 alfalfa materials注：1-GNKH-1，2-GNKH-2，3-GNKH-3，4-俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿，5-金皇后苜蓿，6-阿爾岡金苜蓿

2.3 生產性能綜合評價

由于供試苜蓿材料的來源不同、基因型不同，其在形態特征和產量及品質指標上變化非常大，很難用一個或幾個指標對其作出準確的評價。因此，選擇影響生產性能的主要因子越冬率、干草產量、株高、生長速度、分枝數、葉莖比，采用主成分分析法對6份苜蓿種質材料連續兩年的生產性能進行綜合評價。

根據綜合評價函數，計算各種質材料的綜合得分(表5)，給予供試苜蓿材料定量化的描述，綜合得分越大，表明綜合表現越好。高寒濕潤氣候區各苜蓿材料主成分分析綜合得分值排名為：GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>金皇后。GNKH-3的綜合得分最高，在高寒濕潤氣候區的適應能力最強；其次是GNKH-2和GNKH-1，它們在高寒濕潤氣候區的適應能力較強；俄羅斯西伯利亞雜花和金皇后的綜合得分最低，它們在高寒濕潤氣候區的適應能力最弱(表5)。

3 討論

3.1 物候期及農藝性狀差異

植株整個生育期的生長是植物自身對外界生態因子適應性的反應。供試苜蓿材料在高寒濕潤氣候區生育期差異顯著，GNKH-3、GNKH-2返青期最早，阿爾岡金返青期最遲，比抗寒苜蓿品系晚5 d。3個抗寒苜蓿品系的物候期與暢云喜等[16]在青藏高原觀測的抗寒苜蓿新品系的物候期差別不大。

表5 在高寒濕潤氣候區供試苜蓿材料綜合得分及排名

潘正武等[17]于2009～2011年在天祝高寒濕潤氣候區和西藏“一江兩區”進行品種比較試驗，挑選出了適應性較高的抗寒苜蓿品種苜蓿王等[18]。陳玲玲等[19-27]對國外苜蓿的研究表明，其物候期、株高、產量、分枝數、葉莖比等農藝性狀的差異較大，這與青藏高原的高寒環境有著直接的關系，由于海拔高、氣候多變、溫差較大、降水時間不均勻，適宜苜蓿生長的時間相對較短(5～8月)，致使苜蓿生長緩慢，無法完成整個生育期。越冬率是最重要的一個抗寒生理指標，其大小可以反映苜蓿品種的抗寒能力。在低溫脅迫下，植株的越冬率越高，抗寒性越強，越能適應高寒氣候。試驗所用的抗寒苜蓿品系在高寒濕潤氣候區兩年平均越冬率比對照材料高，其中，GNKH-3、GNKH-2越冬率均超過80%。高寒濕潤氣候區兩年的平均干草產量均是抗寒苜蓿品系顯著高于對照苜蓿材料(P<0.05)，其中GNKH-3最高，GNKH-2、GNKH-1次之。有研究表明植株高度是衡量牧草生長狀況的重要指標，與產量呈正相關，高植株通常有更高的相對產量潛力[21-22]，這與試驗結果相一致；高寒濕潤氣候區3個抗寒苜蓿品系株高比對照的3個苜蓿材料高，他們之間差異不顯著。生長速度在一定程度上反映苜蓿生長能力的強弱[23]，高寒濕潤氣候區兩年的平均生長速度為抗寒苜蓿品系高于對照苜蓿材料。牧草分枝(分蘗)數的多少在一定程度上影響其生產性能的高低[24]，苜蓿由于分枝數的增多，干物質產量也隨之增加，高寒濕潤氣候區兩年的平均分枝數抗寒苜蓿品系多于對照苜蓿材料，因此，干草產量也較高。供試材料高寒濕潤氣候區兩年的平均葉莖比以GNKH-3最高，達到了1.02。

3.2 ISSR分子標記的檢測效率及材料的遺傳多樣性分析

分子標記己經成為苜蓿育種中的重要輔助選擇手段。用8對引物在供試苜蓿材料中共獲得87條擴增帶，其中54條具有多態性，引物的多態位點百分率62.07%。李紅等[15]用10個引物對30份苜蓿材料共擴增出112條帶，其中59條帶是多態性條帶，多態性比率的平均值為74.5%。李哲等[16-17]用4條引物對39份苜蓿材料共擴增22條帶，其中21條為多態性條帶，多態性比率為95.45%。張穎娟等[25]用13條引物對12份苜蓿材料共擴增出346條帶，多態性條帶332條，多態性條帶百分比為95.95%。擴增產物的多態性，能反映材料的遺傳多樣性[26]，以此為依據，供試苜蓿種質資源具有較豐富的遺傳多樣性。與多態位點百分率相比，基于Nei’s基因多樣性指數和基于條帶表型頻率的Shannon’s信息指數更能客觀地衡量材料的遺傳多樣性水平[27]，研究的Nei’s基因多樣性指數和Shannon’s信息指數分別為1.494 3和0.384 2，進一步表明供試苜蓿種質資源具有一定水平的遺傳多樣性。

3.3 供試材料間的親緣關系分析

遺傳相似系數是反映個體之間遺傳相似程度和遺傳背景一致性的度量值。3個抗寒苜蓿品系間的遺傳相似性為0.873 7～0.954 0，對照材料間的遺傳相似性為0.747 1～0.862 1，材料間的遺傳相似程度較高，親緣關系較近。此次研究親本材料阿爾岡金、隴東苜蓿、金皇后苜蓿在海拔3 050 m的青藏高原連續種植很多年，抗寒性能得到長期馴化，在選育過程中移植到暖溫地帶，又移植到青藏高原高寒地區，進行多帶馴化，抗寒能力得到提高，選育的抗寒苜蓿新品系與親本材料形成明顯的差異，GNKH-1與親本阿爾岡金的遺傳相似性為0.517 2；GNKH-3與親本金皇后的遺傳相似性為0.5517，遺傳距離增大，遺傳多樣性豐富。GNKH-3與阿爾岡金間的遺傳相似性最小，為0.482 8，說明它們在親緣關系上離得最遠，3個抗寒苜蓿品系與對照材料的遺傳相似性都比較小，介于0.482 8～0.666 7，表明抗寒苜蓿品系與對照材料的親緣關系相對較遠，具有相對獨立的遺傳特性。

根據6份供試苜蓿材料的親緣關系系統樹，在遺傳距離0.78處將6個苜蓿供試材料分為2類。第1類包含GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3 3個抗寒苜蓿品系材料，具有高產、越冬率高、生產性能強的特點；第二類包含俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后、阿爾岡金苜蓿3個對照品種材料，其產量、越冬率、生產性能相對第1類材料較低。在遺傳距離0.90處，GNKH-3單獨聚類，為青藏高原地區抗寒苜蓿品種的選育提供了理論基礎。GNKH-1和GNKH-2各方面表現僅次于GNKH-3。因此，在常規育種實踐中，采用集團選擇法在原有種質資源中發掘新的、有變異的種質資源及遺傳特性相對獨立的材料具有重要意義。

青藏高原缺乏適應性能好、高產優質的苜蓿品種，GNKH -3，GNKH-1和GNKH-2的選育為在東北緣區域實現苜蓿的產業化提供了物質基礎，有望解決青藏高原東北緣區豆科飼草缺乏的問題，實現高寒牧區家畜的營養平衡和健康養殖。

4 結論

(1)高寒濕潤氣候區各苜蓿材料主成分分析綜合得分值排名為：GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>金皇后。GNKH-3的綜合得分最高，在高寒濕潤氣候區的適應能力最強；其次是GNKH-2和GNKH-1。

(2)在遺傳距離 0.78處將6個供試苜蓿材料分為2類。第1類包含GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3抗寒苜蓿品系材料，在高寒濕潤氣候區具有高產、越冬率高、生產性能強的特點；第2類包含俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后、阿爾岡金苜蓿3個對照品種材料，其產量、越冬率、生產性能相對第1類材料較低。在遺傳距離0.90處，GNKH-3單獨聚類。GNKH-3為高寒濕潤氣候區最理想的優良苜蓿品系，GNKH-2次之。