土傳病原真菌及其生防細菌的分離鑒定

蘇 靜，李雙明

(1.甘肅農業大學 植物保護學院，甘肅 蘭州 730070； 2.解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院病理科，甘肅 蘭州 730050)

土壤既是土傳病原真菌的源，同時也是生防微生物的源。科學研究工作者經常從發病植株的根際篩選生防微生物。德國微生物學家Lorenz Hiltner于1904年首次提出根際的概念為根系周圍、受根系生長影響的土體[1,5]。根際作為根系、土壤界面的一個微環境，是土壤-根系-微生物三者緊密結合、相互影響的場所[5-6]。植物根際土壤中存在豐富多樣的細菌，放線菌和真菌菌株，包括具有豐富的生防功能的菌株。生防微生物通過與病原微生物的競爭、拮抗、抗生和重寄生等達到抑制或消滅病原微生物，通過誘導寄主植物抗病性、分泌植物生長激素和溶磷解鉀固氮等促進植物生長[7]。有關植物病害生防細菌資源的研究和應用已成為病害生防領域的熱點，在“兩減”的大背景下具有廣闊的前景。

草坪球場和農田系統類似，都容易產生連作障礙，持續受到土傳病害的侵染，從而降低其生產力。將分離自甘肅農業大學草坪實訓基地的土傳真菌，通過離體葉片和皿內幼苗接種土傳真菌分離物測定其致病性，利用形態學鑒定方法確定其分類地位；在此基礎上，通過平板稀釋法分離根際微生物，利用皿內拮抗試驗篩選拮抗細菌，結合形態學和分子鑒定方法確定拮抗菌的分類地位。旨在明確甘肅農業大學草坪實訓基地的土傳病原真菌種類，并篩選相應的生防細菌，為科學管理實訓基地提供理論基礎，并為生防細菌資源進一步開發利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 區域概況

試驗地處于甘肅省蘭州市安寧區甘肅農業大學草坪實訓基地。地理坐標為N 36°9′，E 103°7′，海拔1 531 m，氣壓84 KPa。溫帶大陸性氣候，年均氣溫10.3 ℃。年均日照時數2 446 h，無霜期180 d，年平均降水量327 mm。實訓基地內草坪草主要為高羊茅(Festucaelata)和黑麥草(Loliumperenne)混播，還有紫羊茅(Festucarubra)和翦股穎(Agrostismatsumurae)等。

1.2 土壤采樣

試驗以甘肅農業大學草坪實訓基地土壤為研究對象，隨機設置5個3 m×3 m的樣地，在樣地內采用5點取樣法，用直徑為5 cm的土鉆鉆取0～20 cm的土壤，將土壤均勻混合后裝入無菌聚乙烯自封袋，轉至冰盒保存并帶回試驗室于當天分離培養土壤微生物。

1.3 土壤微生物的分離與形態學鑒定

稱取10 g含根土樣，置于盛有90 mL無菌水的(加玻璃珠)三角瓶中，在搖床上以150 r/min振蕩15 min后制成10-2懸液后備用。

采用平板涂抹法涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL)，每皿200 μL懸液進行真菌的分離，3個重復，接種后置25±1℃恒溫箱培養5 d，對分離菌株進行統計、編號、純化保存。將純化菌株接種于PDA平板上，每隔24 h觀察菌落形態和顏色；并制作玻片置生物顯微鏡下觀察其產孢結構及分生孢子形態等,并進行鑒定[8-11]。

采用平板涂抹法涂布于營養瓊脂培養基(NA：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL)，每皿200 μL懸液進行細菌的分離，3個重復，轉置28±1℃恒溫箱培養3 d后,對分離菌株進行統計、編號、純化保存。以備土傳病原真菌的拮抗試驗和細菌分離物的鑒定，將純化菌株劃線接種于NA平板上，24 h后觀察記錄菌落形態、大小、光澤、質地及培養基的顏色等特征[12]。

1.4 真菌分離物的致病性測定

(1)離體植物組織接種法[13]：采集健康的黑麥草的莖基部(長3 cm)，轉至培養皿(9 cm)造傷口接種土壤真菌分離物的分生孢子懸浮液(空白對照接種無菌水)，于25±1℃光照培養箱內黑暗保濕培養48 h后正常12 h光暗交替培養，3個重復，3 d后觀察記錄離體葉片侵染癥狀。(2)皿內發芽接種法[14]：將分離物在PDA培養基上培養5 d后打成直徑5 mm的菌餅轉置皿內發芽后的健康無病的黑麥草(每皿10株)幼苗，以接種5 mm PDA培養基餅為對照，3次重復，連續觀察記錄皿內苗的發病情況。

新聞發布會由滕州市委宣傳部副部長魏峰主持。在新聞發布會上，滕州市農業系統黨委書記、農業局局長李廣耀介紹了滕州馬鈴薯產業融合發展和節會有關情況。

1.5 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙培養法將病原真菌置于PDA培養基上活化培養5 d，后打成直徑為5 mm的菌餅，接種在PDA培養基中央，土壤根際細菌分離物純培養物經24 h活化培養后點接在距菌餅2.5 cm處，每平板4點，以點接無菌水為對照，25℃培養，3次重復，待對照病原真菌長滿培養皿后，測量處理菌落直徑(cm)，以抑菌率表示細菌的抑菌能力[15]。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.6 拮抗菌株的16S rDNA基因鑒定

細菌DNA提取：細菌活化后在NB培養液中28℃振蕩過夜培養，使用天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，目錄號，DP302)，進行細菌DNA的提取，方法參照試劑盒說明書。

細菌基因擴增[16]：使用27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492 R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)為引物(武漢金開瑞生物工程有限公司合成)，擴增菌株的16S rDNA。PCR體系建立(50 μL)：PremixTaq25 μL，1492R 1 μL，27F 1 μL，DNA 1 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個循環；72℃終延伸5 min。將PCR擴增產物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行檢測。將測得的DNA序列提交GenBank數據庫取得序列號。

1.7 系統發育樹構建

將測序后獲得的細菌的DNA序列分別提交到NCBI網站中的Blast進行序列比對，并根據NCBI數據庫中下載的序列信息，利用 MEGA(6.0)軟件進行多重序列比較，并采用Neighbor-Joining法構建16S rDNA系統發育樹。

2 結果

2.1 土傳真菌多樣性及其致病性

從草坪實訓基地的土壤中分離得到18株真菌分離物，按照菌落形態特征將其歸類為5種真菌分離物并編號為GSAF1、2、3、4和5(表1，圖1)。根據真菌的形態學特征(圖2)，初步將GSAF1，4和5分別鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.)、立枯絲核菌(Rhizotoniasolani)和鐮孢菌屬(Fusariumsp.)，GSAF2和3暫時未明，有待分子鑒定方法進行分析。通過離體葉片和皿內發芽致病性測定試驗，接種孢子懸浮液和菌餅7 d后土傳真菌GSAF1，4和5對黑麥草的離體莖基部和皿內幼苗表現出了侵染癥狀，表明這3種土傳真菌在室內具有一定的致病性(表1)。

2.2 根際土壤細菌分離及拮抗菌篩選

從土壤中分離得到12株細菌分離物，編號為ZSR20-ZSR32，經平板對峙拮抗篩選結果表明， 3株細菌對鏈格孢屬、立枯絲核菌和鐮孢菌屬有拮抗效果，其中菌株ZSR30的抑菌能力略高于菌株ZSR32，對3種土傳病原真菌的抑菌率均高于30%，對立枯絲核菌的抑菌率達36.2%；ZSR32菌株對3種病原真菌也有一定的抑菌作用；ZSR26對3種土傳病原真菌的拮抗抑菌作用較低，抑菌率均小于20%(表2)。其余菌株未見拮抗能力。

表1 草坪實訓基地土壤真菌種類及其室內致病性測定

注：+，致病；-，不致病

圖1 5種土傳真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的單菌落形態特征Fig.1 The morphology of single colony of 5 soil-borne fungi cultured on potato dextrose agar

圖2 土傳真菌細胞形態特征Fig.2 The morphology of soil-borne fungi cell注：A(GSAF1) 鏈格孢屬；B(GSAF4) 立枯絲核菌；C1-C3(GSAF5) 依次為鐮刀菌屬的大型分生孢子，小型分生孢子和厚垣孢子

具有拮抗能力的3株細菌分離物的形態特征為，ZSR26：G+，菌體桿狀，單菌落近圓形，呈柳絮狀，稍有凸起，接近白色，稍有光澤，邊緣不整齊，有褶皺，半透明，略有粘度，直徑3～8 mm(圖3A、A1)；ZSR30：G+，菌體桿狀，單菌落圓形或近圓形，中間凹陷，接近白色，邊緣不整齊，有褶皺，稍有光澤，不透明，有粘度，直徑8～10 mm(圖3B、B1)；ZSR32：G+，菌體桿狀，單菌落近圓形或圓形，且稍凸起，接近白色，邊緣不整齊，有褶皺，半透明，略有粘度，直徑4～8 mm(圖3C、C1)。

表2 3種細菌分離物對3種土傳病原真菌的抑菌效果

圖3 3種根際細菌分離物在營養瓊脂培養基的形態特征及革蘭氏染色的菌體形態Fig.3 The morphology of single colony of three soil-borne bateria cultured on nutrient agar and their Gram stain

2.3 拮抗細菌的16S rDNA鑒定

成功提取拮抗細菌基因組DNA并擴增出16S rDNA序列(圖4)。經16S rDNA序列相似性分析和構建系統發育分析。測定的基因序列分別為，ZSR26(1384 bp)，ZSR30(1 412 bp)和ZSR32(1 417 bp)(表3)。

圖4 ZSR26，ZSR30和ZSR32菌株PCR產物電泳圖Fig.4 Electrophoregram of PCR products of ZSR26,ZSR30 and ZSR32

其序列與GenBank中已報道的序列比較，結果表明：ZSR26的99%相似于內生芽孢桿菌(MH168995.1，GU339236.1和KX783541.1)；ZSR30和ZSR32的99%相似于芽孢桿菌屬(MF139324.1，JF496436.1，JF496449.1)。鑒于未結合其他鑒定手段，初步將ZSR26，ZSR30和ZSR32菌株均鑒定為芽孢桿菌屬Bacillussp.。

表3 細菌分離物ZSR32，ZSR30和ZSR26的16S rDNA序列分析

圖5 3株拮抗細菌的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic trees of 3 antibiotic bacteria

3 討論

土壤含有豐富的有機物，為其中的真菌、細菌、線蟲以及原生動物等提供了基礎營養，同時也構成了動態平衡的土壤中的食物網。土壤中某一類微生物的富集，往往容易擾亂系統，打破平衡，從而衍生一系列問題。薛泉宏等[17]報道，在同一田塊連續多年種植同一作物會導致該作物產量和品質下降,病蟲害加重,連茬作物生產力下降，土壤生物退化。甘肅農業大學草坪實訓基地始建于2007年，多年重復利用黑麥草和高羊茅建植的草坪，土壤中存在大量的鏈格孢屬，立枯絲核菌和鐮孢屬的真菌，其菌在室內對黑麥草離體莖基部和皿內幼苗具有致病性，與其他研究中的3種菌的致病性的報道一致[18-19]。研究中立枯絲核菌和鐮孢屬可以引起多種作物和牧草的葉斑、莖基腐、根腐等病害，是土傳病害的重要病原，同時也是土壤退化的重要指示病原真菌[3]。鏈格孢屬存在于多種生態環境下，可以引起如馬鈴薯早疫病、番茄早疫病等病害，可存活于土壤中。鏈格孢屬，立枯絲核菌和鐮孢屬存在于草坪實訓基地土壤中，隨著種植年限的延長，它們將成為草坪可持續利用的重要限制因子，應因地制宜、生態環保地進行綜合管理，提高草坪利用年限。

芽孢桿菌屬(Bacillussp.)對各種環境條件具有很強的適應性，廣泛地存在于土壤，水和空氣中，與自然界中的物質轉化、土壤肥力、環境衛生等均密切相關[20]。有的能水解淀粉，分解蛋白質、果膠、藻酸鹽等，工業上用于提取淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等[20]。有的能分泌IAA、溶解無機磷和有機磷，還可以解鉀，同時對多種作物的真菌性病害具有拮抗抑制作用，是重要的生防菌，被廣泛的應用于農業生產中，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.faciens)[21-22]。試驗從實訓基地的土壤中分離得到了3株芽孢桿菌屬的細菌，且對土傳病原真菌具有較好的拮抗作用，為實訓基地內因地制宜和生態環保的控制土傳病原真菌提供了菌種資源，為進一步開發利用奠定了理論基礎。

4 結論

采用平板稀釋涂抹法從甘肅農業大學草坪實訓基地的土壤中共分離得到18株真菌分離物和12株細菌分離物。室內致病性測定表明真菌分離物GSAF1，4和5具有致病性，經形態學鑒定初步明確它們為鏈格孢屬、立枯絲核菌和鐮孢屬。采用皿內拮抗法篩選了12株細菌分離物對3種土傳病原真菌具有拮抗作用的3株細菌，抑菌率最高為36.2%。結合形態學和16S rDNA分子鑒定方法，初步將ZSR26，30和32均鑒定為芽孢桿菌屬。