應用RAPD標記檢測淮山種質資源的遺傳多樣性

蔡錦玲 凌永勝 林文磊

摘要 采用RAPD標記對7份德化淮山種質進行遺傳多態性和遺傳距離分析，并構建聚類圖。從63個RAPD引物中篩出31個多態性較好的組合，擴增得到了156個多態性標記。結果表明，7份淮山種質依據遺傳距離可分為2類，組間的遺傳距離為0.32，其中，大銘薯、泉淮1513和泉淮1547的親緣關系較近，組內的平均遺傳距離為0.21，另一類組內的平均遺傳距離為0.44。對照田間表型可見，聚類結果相近于傳統分類結果。利用RAPD標記能有效地分析淮山的遺傳多樣性，對雜交優勢的利用具有較大的指導意義。

關鍵詞 淮山;種質資源;RAPD;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號 S 632.1 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）12-0120-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.032

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract To analyze the genetic polymorphism and genetic distance of 7 Dehua Dioscorea opposita germplasm by RAPD markers，and build the cluster diagram，31 combinations with good polymorphism were screened out from 63 RAPD primers，and 156 polymorphic markers were amplified.The results showed that 7 D. opposita germplasms could be divided into two groups according to genetic distance，and the genetic distance between groups was 0.32.Among them，Damingshu，Quanhuai 1513 and Quanhuai 1547 were closely related，with an average genetic distance of 0.21 in the group，the mean genetic distance in the other group was 0.44.Compared with the field phenotype，the clustering results were similar to the traditional classification results.The genetic diversity of D. opposita can be effectively analyzed by RAPD markers，which is of great guiding significance for the utilization of hybridization.

Key words Dioscorea opposita Thunb.;Germplasm resources;RAPD;Genetic diversity;Cluster analysis

淮山屬于薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.）的塊狀根莖，為纏繞性藤本植物[1]，是集醫用、養生、保健、食用、飼用于一身的一種高效率經濟作物，其肉質鮮美，風味特別，具有滋補脾胃肺腎，增強人體免疫能力，抑制腫瘤細胞生長，抗氧化活性等作用[2]?；瓷皆谖覈脑耘鄽v史已有2 000 余年，原產于我國沿海地區及東南亞一帶，現今在全國各地均有種植[3]。由于其栽培歷史長、地域廣，在栽培生產和銷售市場上一直存在同名異種和同種異名的狀況，使得淮山種質資源的推廣與開發更為艱難。目前國內尚未統一淮山“種”以下第一階梯的分類標準，因此淮山種質資源的鑒別不僅有利于其開發利用，而且可為遺傳育種提供理論支撐。

近年來，DNA分子標記技術相繼出現，如RAPD、RFLP、SSR以及SNP等，其中隨機擴增多態性DNA標記RAPD（random amplified polymorphic DNA）具有操作方便和多態性檢測率高等優勢，被廣泛應用于材料鑒定、系譜親緣及進化關系的研究[4]。如李明軍等[5]優化了山藥基因組RAPD分子標記技術方案;華樹妹等[6]采用RAPD分子標記分析了福建省34份山藥遺傳多樣性;黃春洪等[7]使用RAPD分子標記技術對國內11個盾葉薯蕷居群的遺傳多態性進行了研究;同時國外也報道了利用RAPD分子標記技術構建山藥的遺傳圖譜[8]。筆者擬用RAPD分子標記研究分析7個淮山種質資源的遺傳多樣性，以期為淮山遺傳育種和雜種優勢的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇來自德化的7份淮山種質資源為供試材料，其中德化本土品種2個（下涌薯、大銘薯），新品系5個（

泉淮紅皮白肉、泉淮1515、泉淮1517、泉淮1513、泉淮1547）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取。參照Saghai-Maroof等[9]方法，采用CTAB小樣法提取山藥幼葉基因組總DNA。

1.2.2 PCR反應體系。RAPD引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，共合成了63個引物。反應體系參考華樹妹等[6]的優化體系進行。采用20 μL PCR體系：模板DNA （20 ng/μL）1 μL，10×Easy Taq Buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.4 μL，引物（10 μmol/L）0.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，37 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40個循環;循環結束后在72 ℃的反應條件下延伸10 min。反應終止后4 ℃保存，PCR擴增產物用l %的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 標記采集。統計各樣本的RAPD擴增條帶（有帶讀1，沒有帶讀0，只讀有多態性的標記）。

1.2.4 數據處理。2個樣本X與Y之間遺傳距離的計算參照Nei等[10]提供的計算公式：GDxy =1-2Nxy/（Nx+Ny），其中，Nxy為樣本X與Y所共有的帶;Nx為X樣本所有的帶;Ny為Y樣本所有的帶[10]。組內平均遺傳距離取組內材料間遺傳距離的平均值;組間平均遺傳距離取不同組間材料遺傳距離的平均值;材料平均遺傳距離為某一材料與其他所有供試材料遺傳距離的平均值。用非加權平均法（UPGMA）構建材料間的聚類圖。遺傳距離的計算和聚類圖的構建采用R軟件包[11]。

2 結果與分析

2.1 淮山種質資源分析評價

調查顯示，泉淮1517、下涌薯、泉淮1515和泉淮紅皮白肉長勢旺盛，莖蔓棱翼四棱形，葉片較大、厚紙質，葉柄長，葉基出脈數均為7條，無零余子。泉淮1513、泉淮1547和大銘薯的莖蔓棱翼圓形，葉片中等、薄革質，葉柄較短，有較多橢圓形或長橢圓形的零余子。其中，下涌薯中熟，產量一般，粗多糖等品質成分含量較高，商品性差，中感炭疽病;泉淮紅皮白肉中熟，豐產穩產性好，品質成分含量較高，較抗炭疽病;泉淮1515中熟，豐產又穩產，品質成分含量一般，中感炭疽病;泉淮1517中熟，豐產性好但穩產性差，品質成分含量一般，商品性差，中抗炭疽病;大銘薯中晚熟，產量較低，品質成分含量較低，抗炭疽病;泉淮1513中晚熟，產量低，品質成分含量較低，抗炭疽病;泉淮1547中晚熟，豐產穩產性較好，品質成分含量較高，商品率高，抗炭疽病。

2.2 RAPD標記的多態性

從63個RAPD引物中篩選出31個多態性較好的引物對7個淮山種質資源進行分析，片段長度在200～2 000 kb。一共得到156個多態性標記，平均每個引物5.03個，引物擴增出多態性位點最多達10個。表1為31個隨機引物的引物編號及序列，圖1是RAPD引物A-20電泳結果。

2.3 遺傳距離分析

RAPD標記計算的各淮山種質資源之間的平均遺傳距離為0.37～0.49，總平均遺傳距離為0.45（表2）。依據遺傳距離的大小，分為2類，組間的遺傳距離為0.32，第一類群的平均遺傳距離為0.44， 較第二類群的平均遺傳距離（0.21）遠，說明第一類群的淮山種質遺傳多樣性大;其中，泉淮紅皮白肉的平均遺傳距離0.49為最大，泉淮1547的平均遺傳距離最小，僅為0.37，說明泉淮紅皮白肉具備較為豐富的遺傳變異性。

2.4 聚類分析

應用RAPD分子標記對7份淮山種質資源進行聚類分析，結果顯示：下涌薯、泉淮紅皮白肉、泉淮1515和泉淮1517品種間具有較大的遺傳相似性，聚在了同一類;大銘薯、泉淮1513和泉淮1547的遺傳相似性接近，單獨成一類。聚類結果和遺傳距離的結果相一致，說明通過這兩大類群間雜交選育可獲得更高的遺傳變異。

3 討論與結論

3.1 討論

作為研究作物種質資源親緣關系的一項技術，RAPD標記具有檢測容易、靈敏度高、引物無種屬界限等特點，因此較其他鑒定技術如同工酶鑒定技術等更為有效。同時，與其他分子生物學檢測技術一樣，RAPD標記容易受PCR反應體系中各組分濃度以及PCR儀器性能等因素的影響產生假帶，穩定性也相對較差。因此，需要摸索其合適的反應條件，并對試驗結果反復驗證。

該研究通過RAPD方法測定了來源不同的7個淮山種質資源，得到的聚類結果與傳統形態學分類結果有一定的一致性。聚類結果將7個淮山種質資源在平均遺傳距離指數為0.45處分為A和B共2組，A組中的泉淮紅皮白肉和泉淮1517在產量上較下涌薯與泉淮1515高，與聚類分析中顯示出的泉淮紅皮白肉和泉淮1517遺傳距離較遠結果相一致;B組中的大銘薯、泉淮1513和泉淮1547在葉形、莖蔓形態和產量等方面相接近，在傳統形態學分類上可以分為同一類。可見，供試的7個淮山種質資源遺傳親緣關系與其產量存在一定相關性，詳細情況可待進一步研討。

3.2 結論

RAPD分子標記在淮山的遺傳多樣性分析中具有較高的多態性，能夠幫助研究者在基因組的DNA水平上掌握其多樣性，可嘗試選擇遺傳距離較遠的親本進行配組雜交，獲得遺傳變異豐富的后代材料。該研究結果表明：泉淮紅皮白肉與其他供試淮山種質資源存在大的遺傳距離，具有較大的遺傳變異，通過配組雜交，較容易獲得綜合性狀好的后代材料;而大銘薯、泉淮1513和泉淮1547的遺傳多樣性較低，應該優先考慮與類群外的親本材料配組雜交，才能進一步擴大其遺傳多態性。

參考文獻

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