興安杜鵑基本培養基和外殖體選擇的初步研究

杜鳳國 呂偉偉 王歡

摘要 [目的]研究興安杜鵑苗木快繁技術，為興安杜鵑大規模園林綠化應用提供技術保障。[方法]以興安杜鵑的葉芽、花芽、葉片、莖尖、莖段為外植體，以MS、WPM、Read、B5為培養基，采用不同采集時間、不同消毒方法，通過接種、培養、觀察和對比分析，對興安杜鵑的快速繁殖進行研究。[結果]興安杜鵑組織培養最佳基本培養基為WPM培養基;最佳外植體為1.5～2.0 cm莖尖和莖段;最佳滅菌方法為70%乙醇30 s結合0.1% HgCl2 10 min;最佳取材時間為3月中旬至5月中旬。[結論]該研究可為綠化苗木生產、城鎮綠化及鄉村振興生態宜居目標的實現提供支撐。

關鍵詞 興安杜鵑;組織培養;快速繁殖

中圖分類號 S 685.21 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）12-0136-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.037

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]To study the rapid propagation technology of Rhododendron dauricum seedlings， and provide technical support for the largescale landscaping application of Rhododendron dauricum.[Method]The leaf buds， flower buds， leaves， stem tips and stem segments of Xing'an Rhododendron were used as explants， and MS， WPM， Read B5 were used as the medium.The rapid propagation of Rhododendron dauricum ?studied by using explants with different sampling time and disinfection methods through inoculation， culture， observation and comparative analysis.[Result]The best basic medium for tissue culture of Rhododendron dauricum was WPM;the optimal explants was 1.5-2.0 cm long stem tips and stem segments;the best sterilization method on the surface of explants was 70% alcohol 30 s and then combined with 0.1% HgCl2 10 min;the best season for sampling time was from midMarch to midMay.[Conclusion]This research can provide technique to reproduction of greening seedlings，urban greening and realization of ecological livable target ?in rural vitalization.

Key words Rhododendron dauricum;Tissue culture;Rapid propagation

興安杜鵑（Rhododendron dauricum L.）又名金達萊、滿山紅、達子香、映山紅等，屬于杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）的落葉或常綠灌木，主要分布于東北地區的大小興安嶺和長白山林區，多生于山脊處的石砬子、陡壁、荒山、干山坡，耐寒冷、干旱和瘠薄。先花后葉，其花紫紅色，十分美麗，香味濃郁。葉和花的提取物具有鎮定、利尿、抗腫瘤的作用，是一種集觀賞、藥用和芳香于一體的經濟價值很高的野生木本花卉，極具開發價值。目前一些學者對興安杜鵑種子及苗木生長特性[1]、生理特性[2]、葉化學成分[3-4]、精油化學成分[5]、藥用價值[6]、種子與扦插繁殖[7-8]等進行了研究;還有學者對同屬的其他種如：杜鵑[9]、西洋杜鵑[10]等組織技術進行了研究。對于興安杜鵑組培技術，雖有學者進行了研究并取得進展，但污染率和褐化率嚴重，只形成部分愈傷組織[11]。隨著城市林業和鄉村振興生態宜居建設的深入推進，興安杜鵑正以它獨特的先花后葉觀賞特性，日益越受到人們的青睞。人們直接

從森林中挖掘野生的興安杜鵑植株栽植在一些城市公園、廣場、道路等園林綠地上，不僅成本高，而且嚴重破壞了森林生態環境。為加快興安杜鵑在城鄉綠化上的應用，必須解決快繁大量優質苗木問題，而組織培養是保持原種優良特性、不受季節限制的一種快繁苗木技術。為此，筆者從基本培養基和外植體選擇等方面研究興安杜鵑苗木組織培養技術，以期為綠化苗木生產、城鎮綠化及鄉村振興生態宜居目標的實現提供技術支撐。

1 材料與方法

2017年3月中旬，從吉林市雷達山上采集興安杜鵑的休眠枝條，在溫室中進行水培，以其萌發的芽作為試驗材料。5月中旬，采集興安杜鵑幼嫩枝條，放于水中進行室內培養，接種時以其幼嫩葉片、莖尖及莖段為外植體。后于7月中旬采集興安杜鵑嫩枝，進行培養。

1.1 材料滅菌

（1）花芽、葉芽的消毒方法。將采下的萌發芽用毛刷刷去表面的浮塵，用洗滌劑輕微刷洗，在自來水中沖洗1 h，可把雜菌洗掉約60%。然后采用3組消毒方法：70%的乙醇中浸泡30 s，再結合0.1%的HgCl2分別消毒6、10、15 min;0.1% HgCl2單獨使用，分別消毒6、10、15 min;70%乙醇30 s。消毒過程中要用玻璃棒不停攪拌，在超凈工作臺上，剝去外層芽鱗，露出內芽，再用無菌水沖洗3～5次。

（2）葉片、莖尖及莖段消毒方法的選擇及接種。用清水將外植體表面沖洗干凈，用70%的乙醇滅菌30 s，然后用0.1%的HgCl2消毒10 min后，在超凈工作臺上用無菌水沖洗3～5次。

1.2 基本培養基的篩選 試驗選用2.0 mg/L ZT+0.5 ?mg/L IBA的激素配比，比較MS、WPM、Read和B5 4種培養基對興安杜鵑快速繁殖的影響。

1.3 最佳外植體的選擇 分別采用花芽、葉芽、葉片、莖尖及莖段5種外植體，研究不同外植體對再生植株的影響，從而篩選出最佳外植體。

1.4 培養條件 培養室溫度（23±1）℃，光照時間為12～14 h/d，光照強度約2 000 Lx。

2 結果與分析

2.1 最佳培養基的篩選 將外植體消毒處理后，分別接種到4種培養基上，附加2.0 mg/L ZT+0.5 ?mg/L IBA，隨機選取葉芽、花芽、莖段、莖尖為外植體進行試驗，觀察外植體反應情況。30 d 后統計污染率、芽分化率，計算增殖倍數，結果見表1。

由表1可見，MS培養基上外植體幾乎全部褐化死亡，偶有存活的，幾乎不形成愈傷組織，形成的嫩枝短小細弱，葉片卷曲，長勢很差。WPM培養基上外植體增殖系數最高，腋芽生長健壯，且腋芽又生腋芽，形成一叢灌木狀小枝，小枝節間較長，葉片比較平展，有利于光合作用，從而為自身提供更多的養分，生長狀況良好;從產生愈傷組織來看，WPM培養基上的愈傷組織直徑較大，愈傷組織黃綠色，致密，生長快，發育良好。Read培養基上外植體腋芽長勢較好，但增殖系數不高，產生的愈傷組織黃白色，疏松，長勢一般，分化少，生長慢。B5培養基上外植體腋芽長勢一般，愈傷組織白色疏松，直徑約1.2 cm，增殖倍數較高，但發育不正常。

觀察比較發現，無論是從不定芽的分化發育情況，還是從愈傷組織的長勢來看，興安杜鵑都在WPM培養基中生長狀況較好。因此，筆者選擇WPM作為興安杜鵑快速繁殖的基本培養基。

2.2 消毒方法的選擇 在查閱文獻的基礎上[3-6]，該試驗選用70%乙醇，消毒30 s，結合不同時間的0.1%HgCl2消毒進行對比，從而選出有效的消毒方法，將外植體接種到WPM+ZT 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L的培養基上，統計染菌率和存活率。由于消毒劑會對植物體產生傷害，因此，需要統計污染率、死亡率和存活率，結果見表2。

由表2可看出，將外植體用70%乙醇消毒30 s后再用0.1% HgCl2消毒10 min的消毒效果最好，存活率可以達到88%。表面消毒劑的使用要求既要殺死材料表面的微生物，又不至于損傷材料組織，影響生長。70%乙醇有更強的穿透力和殺菌力，在其中浸潤30 s，具有浸潤和滅菌的雙重作用，但它也能殺死外植體細胞、組織，會把材料損壞，導致死亡，用70%乙醇消毒的存活率最高也只有28%。消毒時間長短對外植體的存活和污染有很大影響，時間越長，染菌率下降越明顯，如0.1% HgCl2 15 min的污染率（5%）比0.1% HgCl2 6 min的污染率（40%）要低，說明消毒效果要好，可是存活率也隨之下降。考慮外植體的存活及消毒劑作用時間長短的影響程度，試驗確定外植體的最適方法為70%乙醇消毒30 s+0.1% HgCl2消毒10 min，此時外植體的存活率高，污染率也較低。

2.3 最佳外植體的選擇 試驗選擇了水培枝條的花芽和葉芽，野外枝條的莖尖、莖段及葉片作為外植體。花芽和葉芽剝去芽鱗，莖尖、莖段剪成1.5～2.0 cm，葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的方塊接種在基本培養基中，附加ZT 2.0 ?mg/L+IBA 0.5 ?mg/L，30 d后觀察外植體生長分化狀況，結果見表3。

表3表明，從愈傷組織形成來看，莖尖、莖段、葉片均有愈傷組織形成，但是葉片的愈傷組織形成率較低，只有50%，并且葉片的污染率也較高，所以從愈傷組織途徑進行誘導可以選擇莖尖、莖段;從叢生芽的分化上，葉芽的叢生芽分化率為66.66%，增殖系數為2.2倍，而莖尖的叢生芽分化率為83.33%，莖段的叢生芽分化率為83.72%，而且叢生芽的增殖系數較高（達到了3.6～4.0倍），叢生芽生長健壯，生長狀況良好，所以選用1.5～2.0 cm的莖尖和莖段作為外植體。

2.4 最佳取材時期 為了確定最佳取材季節，筆者分別在3月中旬、5月中旬、7月中旬進行了3次取材，接種在基本培養基2.0 mg/L ZT+0.5 ?mg/L IBA上，統計污染率、褐化率以及分化率，結果見表4。

由表4可看出，3月中旬與5月中旬取材的外植體污染率比較低，褐化率都為0，分化率分別達到84.09%和83.33%;而7月中旬取材的興安杜鵑已經半木質化，污染率和褐化程度都比較嚴重，分化率僅33.33%。因此，可以在3月中旬至5月中旬。

3 結論

該試驗得出以下結論：

（1）最佳培養基為WPM培養基。從誘導愈傷組織產生、芽分化和增殖系數綜合考慮，最佳培養基為WPM培養基，但要確定生根階段的最佳培養基，還需要通過進一步的試驗確定。

（2）最佳消毒方法為70%乙醇消毒30 s，而后用0.1% HgCl2消毒10 min。但在選擇消毒劑時，既要考慮其消毒殺菌的能力，還要考慮是否易于被蒸餾水沖洗或可自行揮發。該試驗選用的HgCl2 較難去掉。因此，要充分地沖洗，以達到零殘留。

（3）最佳外植體為1.5～2.0 cm的莖尖和莖段。在快繁時，外植體不能過大，過大消毒不徹底，易于污染，過小組培不易成活。同時，莖尖是樹木的生長點，在來源上往往受到限制。因此，實際生產中可以將莖尖與莖段相結合進行應用。

（4）最佳取材時期為3月中旬至5月中旬。取材過早枝條處于休眠狀態，外植體對于誘導反應遲鈍或無反應，取材過晚外植體在組織培養中易褐化。因此，取材時間以芽萌動和生長季節早期為宜。

參考文獻

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