苦蕎茶多糖誘導人肺腺癌A549細胞凋亡的線粒體機制

楊二萬，張 敏，楊興斌，楊紅燕,*

（1.空軍軍醫大學航空航天醫學系，陜西 西安 710032 ；2.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119 ）

苦蕎（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn）種子經過篩選、烘烤等工序可制成苦蕎茶，因其具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等眾多生物學功能，被認為是一種“健康飲品”而備受歡迎[1-4]。苦蕎茶多糖（tartary buckwheat tea polysaccharide，TBTP）是苦蕎茶最主要的活性成分之一，本課題組利用水提醇沉法結合超聲輔助技術，使TBTP提取率由3%提高至8%左右，為苦蕎茶活性物質研究及應用、推廣提供了一定的理論依據[5-6]。研究表明，苦蕎多糖能夠呈劑量依賴性地明顯清除羥自由基，具有良好的抗氧化活性，使人肝癌細胞染色質DNA斷裂、細胞核形態聚縮，抑制肝癌細胞增殖[7]。Wu等的研究發現蕎麥多糖可誘導白血病細胞分化并抑制其增殖[8]。苦蕎茶和苦蕎在生物活性上有諸多相似之處，而前者作為一種更加便捷的食品，在生活中具有更好的推廣和應用前景。然而，TBTP對腫瘤的影響及作用機制尚不清楚。因此，本研究以超聲波輔助提取的TBTP為原材料，對人肺腺癌A549細胞進行處理，觀察細胞增殖、凋亡情況以及氧化應激損傷指標，探討TBTP對A549細胞凋亡的影響并探索其機制，以期為苦蕎茶保健食品的開發及產品推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎茶購自四川西昌市滋元食品有限公司。TBTP采用超聲波技術輔助水提醇沉獲得，主要包括D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖等，其相對含量依次為4.47%、3.09%、8.55%、2.52%、6.28%、22.08%、12.49%、26.88%和13.64%[7]。A549細胞購自中國科學院細胞庫。

RPMI-1640、胎牛血清 美國Hyclone公司；DHE上海碧云天生物技術有限公司；碘化丙啶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 美國Sigma公司；Mito SOX熒光染料 美國Thermo Fisher公司；Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細胞色素c、剪切型半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、細胞色素c氧化酶IV（cytochrome c oxidase IV，COX IV）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶一抗 美國Abcam公司；線粒體分離試劑盒 美國Biovision公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；多功能酶標儀 德國BMG Labtech公司；GUAVA easy Cyte TM8HT流式細胞儀 美國Millipore公司；凝膠電泳系統、濕轉系統、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；LSM800型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及處理

A549細胞在含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基、5% CO2、37 ℃條件下培養。當細胞生長至80%左右時，分為空白對照組和50、100、200、400、800 μg/mL TBTP處理組，進行相關指標的檢測。

1.3.2 MTT 法檢測細胞增殖

用上述不同質量濃度TBTP分別處理A549細胞12、24、48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT反應4 h，棄去培養液后加入150 μL二甲基亞砜，于37 ℃搖床充分振搖0.5 h，在多功能酶標儀490 nm波長處測定各處理組的OD值。細胞增殖率以各處理組與空白對照組OD值之比表示。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

各組細胞處理結束后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 遍，使用100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC染液充分混勻，再加入5 μL碘化丙啶在室溫、避光條件下染色15 min。染色結束后輕輕混勻細胞懸液，采用流式細胞術檢測細胞凋亡變化。

細胞經Annexin V-FITC和PI雙染之后，流式細胞圖被分成4 個象限：第一象限為晚期凋亡細胞；第二象限為壞死細胞；第三象限為未發生凋亡的細胞；第四象限為早期凋亡細胞。細胞凋亡率＝晚期細胞凋亡率+早期細胞凋亡率，即第一和第四象限百分率之和。

1.3.4 細胞ROS水平檢測

采用DHE染色法檢測細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。接種于共聚焦培養皿中的A549細胞經TBTP處理結束后，使用0.5 μmol/L DHE染液在37 ℃孵箱中染色30 min，再用PBS清洗3 遍，加入1 mL完全培養基后在激光掃描共聚焦顯微鏡下采集熒光信號。DHE紅色相對熒光強度增加表示ROS水平增加。

1.3.5 細胞線粒體ROS水平檢測

采用Mito SOX熒光染料檢測細胞線粒體內ROS水平。接種于共聚焦培養皿中的A549細胞經TBTP處理結束后，使用5 μmol/L Mito SOX染液于37 ℃培養箱染色10 min，再用PBS清洗3 遍，加入1 mL完全培養基后在激光掃描共聚焦顯微鏡下采集熒光信號。Mito SOX紅色相對熒光強度增加表示線粒體ROS水平增加。

1.3.6 細胞線粒體膜電位檢測

A549細胞接種于共聚焦培養皿中，TBTP處理結束后加入10 μg/mL JC-1染液，于37 ℃下孵育15 min，用PBS清洗3 遍后加入1 mL完全培養基，在激光掃描共聚焦顯微鏡下采集熒光信號。當線粒體膜電位低時，JC-1產生綠色熒光；當線粒體膜電位高時，JC-1產生紅色熒光，以紅/綠相對熒光強度比來反映線粒體膜電位的變化。

1.3.7 Western blot檢測凋亡蛋白表達

各組細胞處理結束后，用預冷PBS清洗3 次，加入含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，留取細胞上清液，采用BCA法測定蛋白質量濃度，調至統一質量濃度后100 ℃煮10 min使蛋白變性。進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉，加入相應一抗（體積比為1∶1 000）4 ℃孵育過夜；加入二抗（體積比為1∶5 000）室溫孵育2 h，于凝膠成像系統中曝光、采集圖像，以目的蛋白與相應內參（分別為β-actin和COX IV）條帶相對灰度的比值表示蛋白的相對表達量。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 TBTP對A549細胞增殖的影響

圖1 TBTP對A549細胞增殖的影響Fig. 1 Effect of TBTP on A549 cell proliferation

如圖1所示，TBTP能夠以時間和劑量依賴性的方式抑制A549細胞的增殖。TBTP處理A549細胞12、24、48 h時，隨著質量濃度的增加，細胞增殖率顯著減低（P＜0.05），提示TBTP與A549細胞增殖率間存在劑量依賴關系。同時，相同質量濃度TBTP處理A549細胞時，隨著處理時間的延長，細胞增殖率顯著降低（P＜0.05），提示TBTP與A549細胞增殖率間存在時間依賴關系。100、200、400 μg/mL TBTP處理A549細胞24 h對細胞增殖的抑制作用明顯，且細胞狀態尚可完成實驗，因此進一步的機制研究應用上述條件處理。

2.2 TBTP對A549細胞凋亡的影響

圖2 TBTP對A549細胞凋亡的影響Fig. 2 Effect of TBTP on A549 cell apoptosis

如圖2所示，與空白對照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組細胞凋亡率均顯著增加（P＜0.05）。同時，隨著TBTP質量濃度的增加，A549細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），進一步驗證了TBTP與細胞凋亡率的劑量依賴關系。

2.3 TBTP對A549細胞以及線粒體內ROS釋放的影響

圖3 TBTP對A549細胞以及線粒體內ROS水平的影響Fig. 3 Effect of TBTP on ROS level in mitochondria and A549 cells

如圖3所示，與空白對照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組A549細胞內相對熒光強度均顯著增加（P＜0.05），提示TBTP促進細胞內ROS的產生；隨著TBTP質量濃度的增加，細胞內相對熒光強度也顯著增加（P＜0.05）。Mito SOX熒光染料檢測線粒體ROS水平結果與DHE染色法檢測細胞內ROS水平結果顯示出一致的趨勢，即TBTP能夠呈濃度依賴性地顯著增加線粒體ROS的生成（P＜0.05）。

2.4 TBTP對A549細胞線粒體膜電位的影響

圖4 TBTP對A549細胞線粒體膜電位的影響Fig. 4 Effect of TBTP on mitochondrial membrane potential of A549 cell

如圖4所示，與空白對照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組細胞紅/綠相對熒光強度比均顯著降低（P＜0.05），提示TBTP具有降低細胞線粒體膜電位的作用。隨著TBTP質量濃度的增加，細胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05）。

2.5 TBTP對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

圖5 TBTP對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig. 5 Expression of apoptosis-related proteins in A549 cells after TBTP treatment

如圖5所示，與空白對照組相比，100、200、400 μg/mL TBTP處理組細胞Bcl-2蛋白及線粒體內細胞色素c表達顯著降低，而Bax和剪切型Caspase-3蛋白表達顯著增加（P＜0.05），提示TBTP能夠顯著降低Bcl-2/Bax，促進線粒體細胞色素c釋放及剪切型Caspase-3表達，進而促進細胞凋亡。隨著TBTP質量濃度的增加，Bcl-2/Bax比和線粒體內細胞色素c水平顯著降低，而剪切型Caspase-3表達顯著升高（P＜0.05）。

3 討 論

流行病學資料顯示，肺癌是我國最常見的腫瘤之一，其發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位[9]。80%以上的肺癌患者為非小細胞肺癌，70%左右的患者就診時已屬腫瘤晚期，失去了手術機會，因此化療成為非小細胞肺癌的主要治療手段之一[10]。然而，化療的毒副作用使得部分肺癌患者不能耐受，嚴重影響患者生存和生活質量。植物多糖為天然的大分子生物活性物質，具有抗腫瘤、增強免疫力、抗衰老等多種生物學效應。相較于化學合成藥物，從天然植物分離獲得的植物多糖毒副作用更小且作用機制廣泛，同時，生產工藝的改進為植物多糖的提取提供了依據，因此植物多糖具有廣闊的臨床應用前景[11-14]。TBTP是苦蕎茶中發揮保健功能和具有臨床用途的主要活性物質，但它對肺癌細胞的影響及機制尚不清楚。

本研究發現，TBTP處理能夠顯著抑制A549細胞的增殖，促進細胞凋亡。TBTP在50～800 μg/mL范圍內對A549細胞增殖和凋亡呈現良好的劑量和時間依賴關系。進一步的機制研究結果顯示，TBTP處理顯著促進了A549細胞內和線粒體ROS的生成，降低線粒體膜電位水平，提示它可能通過增加細胞的氧化損傷發揮抑制A549細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。此外，TBTP還呈劑量依賴性地抑制Bcl-2/Bax比，促使細胞色素c從線粒體內外流至細胞質，提高細胞內剪切型Caspase-3的水平，促進細胞凋亡。

苦蕎具有廣泛的生物學活性。賈喬瑾等發現從苦蕎中提取出的苦蕎凝集素能夠抑制結腸癌細胞蛋白合成、調控細胞microRNA水平，因此可以劑量依賴性地抑制3 種結腸癌細胞增殖[15]。郭曉娜等的研究表明，苦蕎蛋白TBWSP31能夠調控乳腺癌Bcap細胞周期，上調抑癌基因Fas的表達，發揮抗乳腺癌的作用[16]。同時，苦蕎種子、殼及莖葉中黃酮、多酚、蛋白等多種成分都對細胞氧化損傷有明確的調控作用[17]。本研究證實了苦蕎茶主要成分TBTP促進A549細胞ROS生成及細胞凋亡的作用，與先前的苦蕎抗腫瘤效應研究基本一致，且豐富了苦蕎的藥理學作用。細胞凋亡是抑制腫瘤細胞生長的主要方式之一，而線粒體是調控該過程最重要的細胞器[18-24]。線粒體為細胞供能的同時會產生ROS，后者成為細胞凋亡的誘導信號分子之一。ROS可直接引起線粒體通透性轉換孔開放，降低線粒體膜電位，一方面影響細胞能量代謝，另一方面致使線粒體內的凋亡啟動因子細胞色素c釋放入胞質，激活Caspase依賴的細胞凋亡途徑[24-25]。Bcl-2家族分子亦參與線粒體形態和功能的調控。研究表明，Bcl-2家族分子，尤其是Bax/Bcl-2同源拮抗劑激活可以促進線粒體分裂蛋白1定位于線粒體外膜，促進線粒體片段化；也可以通過改變Bcl-2/Bax比調節線粒體外膜的通透性，參與細胞凋亡的調控[26-30]。結合本實驗結果，TBTP可能通過調控線粒體ROS生成直接誘導A549細胞凋亡；同時，通過影響Bcl-2/Bax比調節線粒體功能，間接誘導細胞凋亡。

綜上所述，TBTP能夠增加ROS的生成、降低線粒體膜電位，有效抑制A549細胞增殖、促進細胞凋亡，這為苦蕎茶的抗腫瘤效應提供了實驗參考，也為該化合物的臨床應用提供了理論依據。然而，本研究為A549細胞的體外實驗，TBTP抗肺癌作用及機制還需進一步的動物和臨床實驗論證和研究。