N-乙酰-半胱氨酸干預壬基酚對小鼠Sertoli TM4細胞的損傷作用

劉曉珍，聶少平，余 強，黃丹菲，謝明勇,*

（1.東莞理工學院化學工程與能源技術學院，科技創新研究院，廣東 東莞 523808 ；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047 ）

壬基酚（nonylphenol，NP）是環境中普遍存在的化學污染物，被廣泛應用于非離子表面活性劑、防腐劑和著色劑，如日常生活用品中的清潔劑、農藥制劑、水性涂料、化妝品等。據報道，NP是一種環境內分泌干擾物，具有持久性、生物蓄積性、損傷滯后性及低劑量-效應關系，具有雌激素樣作用，可以干擾內分泌激素系統的正常功能，從而導致潛在的生殖問題[1]。通過對果蔬、肉制品、水產品、飲料等的檢測，發現NP普遍存在于各類食品中[2]。NP通過食物鏈、食品加工、食品包裝遷移等途徑進入食品從而對機體造成潛在危害[3]。

目前對雄性生殖毒物的研究主要集中在睪丸。Sertoli細胞是存在于睪丸生精上皮中的一種體細胞，其在雄性生殖活動中扮演重要的角色。研究表明，Sertoli細胞具有為生精細胞提供營養、激素轉化、屏障保護以及吞噬等作用，有關Sertoli細胞的形態和功能的改變以及分子生物學研究已成為雄性生殖研究最活躍的領域[4-5]。另外，有研究表明，睪丸Sertoli細胞是烷基酚類內分泌干擾物作用于雄性生殖系統的靶細胞[6]。

誘導氧化應激和細胞凋亡是環境內分泌干擾物引起多種細胞損傷的主要方式之一，同樣，NP能夠誘導細胞凋亡從而損害生物體[7-8]。N-乙酰-半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是氧自由基清除劑，具有干擾自由基生成、清除已生成的自由基、預防DNA損傷、調節信號轉導系統、抗細胞凋亡等作用。研究報道，抗氧化劑NAC能夠降低毒性化合物引起的細胞損傷[9]。NP作為一種環境內分泌干擾物，可對生殖系統產生危害，尤其是雄性生殖系統，但是其具體的作用機制還不清楚。另外，目前尚缺乏針對NP誘導機體損傷的干預治療相關藥物。因此，本研究通過檢測細胞氧化應激和凋亡相關參數，用培養的Sertoli TM4細胞探索NP誘導生殖損傷的機制，探尋目前發育不全、男性生殖系統發育異常等疾病發病率明顯增加的可能原因。另一方面，以NAC作為干預藥物，探討其對NP誘導的細胞損傷效應的干預作用，從而為NP生物危害的防治策略提供一定的參考。以期發現并評估NP對機體損傷效應的重要指標，為NP的風險評估、建立環境和食品中的控制標準提供依據，同時為NP誘導機體損傷的預防和治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠Sertoli TM4細胞 美國典型菌種保藏中心；DMEM/F12培養基、胎牛血清、馬血清 美國Hyclone公司；NP（純度99.9%）、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；質量分數0.25%胰酶北京索萊寶公司；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodi-hydrof l uorescein diacetate，DCFH-DA）美國Molecular Probes公司；細胞凋亡檢測試劑盒、Caspase-3檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白質量濃度測定試劑盒 碧云天生物技術研究所；細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-JNK蛋白一抗 美國Cell Signaling公司。

1.2 儀器與設備

FACSCaliburTM流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Varioskan Flash E33全波長多功能酶標儀、3110 Series II細胞培養箱 美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；超凈工作臺 上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機 美國Sigma公司；超低溫冰箱 青島海爾電冰箱股份有限公司；Milli-Q50超純水凈化系統 美國Millipore公司；立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；垂直電泳-轉膜裝置、ChemDoc XRS+化學發光成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與處理

Sertoli TM4細胞加入含質量分數2.5%經活性炭/葡聚糖處理胎牛血清和5%經活性炭過濾馬血清的無酚紅DMEM/F12培養基，放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，選用對數生長期生長良好的細胞進行后續實驗。

將培養的Sertoli TM4細胞分為4 組，每個處理組設置3 個復孔。對照組：細胞用培養基處理；NP組：細胞用20 μmol/L NP處理24 h；NP+NAC組：細胞用5 mmol/L NAC預處理4 h后加入20 μmol/L NP處理24 h；NAC組：細胞用5 mmol/L NAC預處理4 h后換與對照組相同體積的培養基培養。

1.3.2 MTT法檢測細胞存活率

將Sertoli TM4細胞以1×104個/孔接種至96 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養6 h或24 h。加入NP處理24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃繼續孵育4 h，終止培養。小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇570 nm波長，在多功能酶標儀上測定各孔OD值，根據OD樣品/OD對照×100計算細胞相對存活率。

1.3.3 細胞內活性氧生成水平檢測

將Sertoli TM4細胞懸液（約2×105個/mL）于3 000 r/min離心10 min，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2 次，用0.5 mL 10 μmol/L DCFH-DA溶液重懸細胞，37 ℃孵育20 min；3 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗2 次，采用激發波長488 nm、發射波長525 nm于流式細胞儀檢測細胞內DCF的熒光強度，每次計數1×104個細胞，用WinMDI 2.9軟件分析活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成水平。

1.3.4 分光光度法檢測細胞內SOD活力、CAT活力、MDA含量以及Caspase-3相對活力

收集Sertoli TM4細胞，PBS洗2 次，利用液氮在37 ℃下進行5 次反復凍融，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，用BCA蛋白質量濃度測定試劑盒測定蛋白質量濃度。按照試劑盒說明書測定細胞內SOD活力、CAT活力、MDA含量以及Caspase-3相對活力。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

胰酶消化收集Sertoli TM4細胞（5×105個/mL），將細胞懸液于3 000 r/min離心10 min，預冷PBS洗2 次后用500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入Annexin V-FITC和PI探針各5 μL，避光反應5 min后立即用流式細胞術檢測各組細胞染色情況。同時以不加Annexin V-FITC及PI探針的細胞樣本作為裸細胞，用于設定流式細胞術檢測條件。

1.3.6 Western blot法檢測ERK1/2、JNK1/2蛋白的磷酸化水平

將Sertoli TM4細胞以2×105個/孔接種至6 孔培養板中。細胞培養24 h后用預冷PBS洗2 遍，加入細胞裂解液，采用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白。用BCA蛋白質量濃度測定試劑盒測定蛋白質量濃度，等量蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（質量分數5%濃縮膠、50 V、30 min；質量分數10%分離膠、100 V、55 min），濕法轉印NC膜。轉印完畢后，NC膜采用牛血清白蛋白封閉2 h，TBST洗3 遍后繼續用JNK1/2、p-JNK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2一抗按體積比1∶1 000稀釋孵育過夜，TBST洗3 遍，再用辣根過氧化物酶標記二抗按體積比1∶5 000稀釋孵育2 h。采用顯影液化學發光顯色反應，采用全能型凝膠成像分析系統成像、Quantity One軟件分析。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 NAC和NP對Sertoli TM4細胞存活率的影響

圖1 NAC干預NP對Sertoli TM4細胞的毒性作用Fig. 1 NAC attenuated NP-induced cytotoxicity in mouse Sertoli TM4 cells

如圖1所示，20 μmol/L NP處理6 h對Sertoli TM4細胞無損傷作用。而與對照組相比，NP作用24 h能夠顯著降低Sertoli TM4細胞的相對存活率（P＜0.05）。經NAC預處理后再用NP作用于細胞，細胞相對存活率與對照組相比無顯著性差異；同樣地，與對照組相比，NAC組細胞相對存活率無顯著變化，表明NAC預處理4 h對細胞無損害作用，并且能夠減少NP引起的細胞損傷。

2.2 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內ROS含量的影響

圖2 NAC對NP誘導的Sertoli TM4細胞內ROS生成的干預Fig. 2 NAC attenuated NP-induced ROS generation in mouse Sertoli TM4 cells

如圖2所示，與對照組相比，20 μmol/L NP處理細胞24 h能夠引起Sertoli TM4細胞內ROS含量極顯著上升。與NP組相比，NAC預處理能夠顯著下調NP誘導的ROS生成量。

2.3 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內抗氧化物酶活力和MDA含量的影響

表1 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內抗氧化物酶活力和MDA含量的影響Table 1 Effect of NAC on NP-induced antioxidant enzyme activities and MDA content in Sertoli TM4 cells

從表1可見，與對照組相比，NP組細胞內的MDA含量極顯著升高。NAC預處理后，細胞內MDA含量極顯著減少，表明NAC預處理可減輕NP引起的Sertoli TM4細胞脂質過氧化。與對照組相比，NP組細胞內SOD、CAT活力極顯著下降。與NP組相比，NP+NAC組細胞內SOD、CAT活力極顯著增加，表明NAC預處理可逆轉NP引起的細胞內SOD、CAT活力下降。這些結果表明NAC具有保護NP對Sertoli TM4細胞的損傷作用，該保護作用與減少細胞內氧化應激的形成有關。

2.4 NAC和NP對Sertoli TM4細胞凋亡的影響

圖3 NAC對NP誘導的Sertoli TM4細胞凋亡的干預Fig. 3 NAC attenuated NP-induced apoptosis in mouse Sertoli TM4 cells

如圖3所示，與對照組相比，Sertoli TM4細胞經20 μmol/L NP處理24 h后，凋亡細胞明顯增加。用5 mmol/L NAC預處理Sertoli TM4細胞后，NP誘導的細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05），這表明NAC對NP誘導的細胞凋亡損傷具有保護作用。

圖4 NAC抑制NP對Caspase-3的激活作用Fig. 4 NAC blocked NP-induced activation of caspase-3 in mouse Sertoli TM4 cells

圖4 顯示NP組、NP+NAC組、NAC組Caspase-3相對活力分別為對照組的（1.48±0.15）、（1.08±0.11）、（0.92±0.09）倍。NP處理激活了細胞內Caspase-3，表明NP可通過激活Caspase-3誘導細胞凋亡。而NAC預處理能夠抑制NP誘導的Caspase-3活力的增加，進一步說明NAC能夠抑制NP對Sertoli TM4細胞的凋亡誘導作用。

2.5 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內JNK、ERK信號通路的影響

圖5 NAC和NP對Sertoli TM4細胞ERK信號通路的影響Fig. 5 NAC blocked NP-induced activation of the ERK signaling pathway in mouse Sertoli TM4 cells

圖6 NAC和NP對Sertoli TM4細胞JNK信號通路的影響Fig. 6 NAC blocked NP- induced activation of the JNK signaling pathway in mouse Sertoli TM4 cells

如圖5、6所示，與對照組相比，NP能夠顯著增加ERK和JNK的磷酸化水平，表明NP激活了Sertoli TM4細胞內ERK和JNK細胞信號通路。進一步研究發現，NAC預處理能夠降低NP誘導的ERK和JNK的磷酸化水平升高。結果表明，NP處理能夠激活Sertoli TM4細胞內JNK和ERK通路，并且ROS參與了該過程，ROS清除劑NAC能夠阻斷這一過程。

3 討 論

作為一種典型的環境內分泌干擾物，NP引起了學術界和公眾的廣泛關注。大量的證據表明，有害化學物質在環境中暴露可誘導機體損傷。Duan Peng等[10]發現NP暴露可引發雄性SD大鼠睪丸生精功能退化、精子數量和質量降低。本研究中NP作用24 h后引起Sertoli TM4細胞存活率顯著降低，表明NP處理可造成細胞損傷。NAC預處理抑制了NP誘導的細胞凋亡，表明NAC對NP誘導的細胞損傷具有保護作用。

ROS的大量生成和脂質過氧化的增加是氧化應激的兩個重要指標。ROS和抗氧化系統之間的平衡與細胞死亡密切相關，ROS的過量生成會誘導線粒體內膜雙磷脂酰甘油的過氧化，從而觸發細胞色素c的游離。SOD、CAT是細胞內重要的內源性抗氧化物酶，可間接反映細胞內的抗氧化水平[11]。MDA為細胞中多不飽和脂肪酸氧化生成的脂質過氧化物，其含量常用以評價脂質過氧化水平[12]。前人的研究發現，NP能夠在多種細胞中誘導ROS的生成，包括Raji淋巴瘤細胞[13]、U937單核細胞白血病細胞[14]、人血中性粒細胞[15]、大鼠原代Sertoli細胞[16]。本研究結果顯示，經NP處理后，Sertoli TM4細胞內ROS生成量和MDA含量顯著增加，抗氧化物酶活力降低，這些結果均說明NP暴露能夠引發Sertoli TM4細胞內氧化應激。

氧化應激被認為是引發細胞凋亡的一個主要機制[17-18]，因此，本研究進一步探究了NP是否能夠通過與ROS生成相關的氧化應激誘導細胞凋亡。結果發現，NP處理細胞24 h后顯著誘導細胞凋亡，證實NP是通過ROS過量生成引起的氧化應激和細胞凋亡誘導Sertoli TM4細胞損傷，這與前期報道結果[19-20]一致。抗氧化劑NAC能夠通過抑制ROS的生成以及維護體內抗氧化系統的平衡從而保護機體或細胞免受有害化學物質的損傷。Ansari等[21-22]報道NAC或者肌肽預處理能夠減緩亞硝酸鹽對大鼠腸道/血液的損傷作用。本研究中，NAC預處理能夠有效抑制NP誘導的氧化應激，主要表現在NAC有效抑制了細胞內ROS的生成、降低抗氧化物酶活力和增加MAD含量，與NAC對NP誘導的氧化應激的干預效果一致。NAC對NP誘導的Sertoli TM4細胞凋亡損傷具有保護作用，主要表現在NAC預處理后，經過NP處理的Sertoli TM4細胞凋亡率和Caspase-3相對活力下降。本研究證明NAC對NP誘導的細胞凋亡損傷具有保護作用，并且NP主要是通過與ROS生成相關的氧化應激誘導細胞凋亡。Huang Wenting等[23]發現NP處理能夠誘導SD大鼠睪丸以及Sertoli原代培養細胞發生氧化應激和細胞凋亡，NAC預處理能夠緩解這一現象，這與本研究結論一致。

近年來，隨著對細胞信號轉導途徑研究的逐步深入，環境內分泌干擾物對信號轉導途徑尤其是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的作用引起了人們的廣泛關注。MAPK信號通路是生物體內重要的信號轉導系統之一，參與介導細胞增殖、分化、凋亡和對環境刺激的反應等。目前已知MAPK具有5 個單元，即JNK1、JNK2、p38、ERK1、ERK2亞家族。而JNK、p38和ERK的磷酸化動態平衡決定了細胞的存活或凋亡。研究報道，大量環境污染毒性物質能夠通過激活MAPK通路誘導細胞凋亡[24-27]，在本研究中，Sertoli TM4細胞暴露于NP下，細胞內ERK和JNK磷酸化水平顯著增加，表明ERK和JNK信號通路參與了NP對細胞的損傷作用。NAC預處理能夠抑制NP對ERK、JNK信號通路的激活作用，該結果進一步證明NAC能夠通過干預ERK和JNK信號通路抑制NP對Sertoli TM4細胞的損傷作用。

綜上，本研究發現NP對Sertoli TM4細胞具有一定的損傷作用，當Sertoli TM4細胞暴露在一定濃度NP環境下，細胞內ROS生成增加、抗氧化物酶活力降低、MDA含量和細胞凋亡率增加，表明誘導細胞內氧化應激和細胞凋亡是NP造成細胞損傷的主要方式之一。同時，ERK和JNK信號通路參與了NP對細胞的損傷作用。NAC預處理能夠抑制NP對Sertoli TM4細胞的損傷作用，主要表現在NAC能夠緩解NP誘導的細胞內氧化應激，抑制NP誘導的Sertoli TM4細胞凋亡，以及阻斷NP激活ERK和JNK信號通路。