魔芋低聚糖緩解高糖水平誘發的大鼠代謝綜合征及相關機制

焦 丹，李浩霞，吳丹丹，周中凱*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457 ）

糖尿病是由胰島素（insulin，INS）分泌不足或INS抵抗導致的以高血糖為特征的一種慢性代謝疾病[1]，其發病率極高，可引起機體糖脂代謝紊亂，進而導致神經病變、視網膜病變、腎功能衰竭、心血管病變等各種并發癥，極大地增加了糖尿病的死亡率[2]。目前糖尿病治療主要以西藥為主，但其存在著嚴重的副作用，因此，尋找天然有機功能因子替代當前藥物治療具有一定的現實意義。

魔芋是一種多年生天南星科草本植物，其塊莖含有豐富的葡甘露聚糖[3]，是其主要的活性成分，已被廣泛應用于食品、醫藥、生物等領域[4-6]。魔芋低聚糖（konjac oligosaccharide，KOS）由魔芋葡甘露聚糖降解而成，具有降血糖、降血脂、清除自由基、提高機體抗氧化能力、抗腫瘤及免疫調節等生理功能[7-9]。楊艷燕等[9]的研究表明，KOS能降低小鼠的血糖水平、提高機體的抗氧化能力；劉瑞雪等[10]的研究表明KOS可明顯改善結腸炎大鼠的臨床癥狀；周中凱等[11]的研究表明KOS可改善肥胖小鼠脂代謝紊亂癥狀。

在分子水平上對糖尿病大鼠糖脂代謝基因表達已取得一些研究進展：張汝學等[12]研究了地黃寡糖對糖尿病大鼠肝臟糖代謝關鍵酶活性及基因表達的影響；王曉鳳[13]通過基因表達研究了蕎麥殼中活性物質對體內外糖脂代謝的影響。雖然國內外目前已有許多關于KOS可調節血糖、血脂、改善糖尿病癥狀的報道，但在分子水平上通過調控糖脂代謝及氧化應激相關基因表達進而緩解糖尿病癥狀的報道尚少。因此，本研究采用尾部靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法誘導SD大鼠，建立糖尿病模型，通過對其體質量、血糖濃度、血清脂質組成以及氧化應激相關指標的測定，分析KOS對糖尿病大鼠糖脂代謝及氧化應激水平的調節作用，并進一步通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術在分子水平上進行作用機制的研究，以期為KOS改善糖尿病糖脂代謝紊亂癥狀提供更深入的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KOS由天津科技大學糧油科學與工程實驗室提供。雄性SPF級SD大鼠，體質量（180±20）g，由中國人民解放軍軍事醫學院實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK-（軍）2014-0001。

基礎飼料 中國人民解放軍軍事醫學院實驗動物中心；STZ 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；動物組織總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）試劑盒、甘油三酯（triacylglycerol，TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、大鼠INS水平試劑盒 南京建成生物科技有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit 大連寶生物工程有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

MK-3酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Step one plus qPCR儀 美國ABI公司；智能培養箱寧波賽福實驗儀器有限公司；XMTD-204數顯式電熱恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器表有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

將40 只SD雄性大鼠隨機分成4 組：正常組（NC）、糖尿病模型組（DC）、KOS低劑量組（L-KOS）、KOS高劑量組（H-KOS）。適應性喂養1 周后，禁食不禁水12 h，稱體質量。參照文獻[14-15]中糖尿病建模方法：尾靜脈注射質量分數2% STZ（現用現配，冰浴；溶劑為0.1 mol/L pH 4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液），注射劑量為45 mg/kg，正常組注射等劑量的緩沖液。72 h后尾靜脈采血,用ONE-TOUCH血糖儀測隨機血糖濃度，以血糖濃度超過16.7 mmol/L作為大鼠建模成功的標準。建模成功后每組9 只大鼠。L-KOS組每天灌胃36.14 mg/kg KOS，H-KOS組每天灌胃69.25 mg/kg KOS，正常組和糖尿病組給予同劑量的純凈水。各組大鼠均自由飲水、進食，喂養4 周。4 周后禁食不禁水12 h，處死大鼠，股動脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上層血清。解剖大鼠，取出肝臟稱質量，快速放入液氮中冷凍，將血清與臟臟置于-80 ℃貯存備用。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 大鼠體質量和空腹血糖濃度的測定

每日對大鼠進行臨床活動度觀察，記錄各組大鼠每周的體質量和空腹血糖濃度。

1.3.2.2 大鼠血清指標的測定

取出備用血清，TG濃度、T-CHO濃度、LDL-C濃度、HDL-C濃度、T-AOC、T-SOD活力、GSH-Px活力、MDA濃度、INS水平測定均按照試劑盒的操作說明書進行，每個樣品做3 次平行。

1.3.2.3 與糖代謝、脂代謝、氧化應激相關基因表達量的測定

取出肝臟樣品，使用TRIzol試劑進行RNA提取。使用PrimeScript RTReagent Kit對cDNA進行逆轉錄并進行逆轉錄qPCR，以18S rDNA基因作內參，每個基因做3 次平行，并根據2-ΔΔCt法計算相對表達量[16]。基因與引物見表1。

表1 基因和引物信息Table 1 Information about the genes and primers used in this study

1.4 數據統計與分析

數據結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 19軟件對數據進行統計，顯著性采用方差分析和鄧肯氏（Duncan’s）差異顯著性分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 KOS對大鼠體質量和空腹血糖濃度的影響

如圖1所示，各組大鼠初始體質量無顯著差異（P＞0.05），說明大鼠實驗分組合理。造模后，與NC組相比，KOS低、高劑量組大鼠體質量增長速度緩慢（P＜0.05），而DC組大鼠體質量增長速度不明顯，且后期有下降趨勢。KOS干預2 周后，與DC組相比，KOS高、低劑量組大鼠體質量顯著升高（P＜0.05）；干預4 周后，與DC組相比，大鼠體質量分別增加了32.05%、22.76%。這表明KOS具有減輕糖尿病大鼠體質量下降趨勢的作用。

圖1 KOS對大鼠體質量的影響Fig. 1 Effect of KOS on body mass of rats

表2 KOS對大鼠空腹血糖濃度的影響Table 2 Effect of KOS on fasting blood glucose of rats

如表2所示，各組初始空腹血糖濃度無顯著性差異，說明個體之間血糖濃度差異性不明顯。注射STZ 72 h后，大鼠的血糖濃度平均值大于16.7 mmol/L，表明造模成功。KOS干預1 周后，與DC組相比，KOS低、高劑量組的空腹血糖水平分別極顯著降低了33.14%、34.50%（P＜0.01）。治療4 周后，與造模72 h后血糖濃度相比，KOS低、高劑量組大鼠血糖水平分別降低了41.99%、39.32%。

2.2 KOS對大鼠INS水平的影響

圖2 KOS對大鼠INS水平的影響Fig. 2 Effect of KOS on INS levels of rats

如圖2所示，與NC組相比，DC組大鼠INS水平顯著降低（P＜0.05）。與DC組相比，KOS干預后2 組大鼠INS水平均顯著升高（P＜0.05），且能達到NC組正常水平（P＞0.05）。這說明KOS可促進大鼠INS分泌，改善糖尿病癥狀。

2.3 KOS對大鼠血脂水平的影響

表3 KOS對大鼠血脂水平的影響Table 3 Effect of KOS on serum lipid levels in rats

如表3所示，與NC組相比，DC組大鼠的TG、T-CHO、LDL-C濃度均顯著增加，HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）。這說明糖尿病易造成大鼠脂代謝紊亂。KOS干預后，與DC組相比，H-KOS組大鼠的TG、T-CHO、LDL-C濃度顯著降低（P＜0.05），HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05）。這說明高劑量的KOS干預對糖尿病大鼠脂代謝紊亂的改善作用顯著。

2.4 KOS對大鼠氧化應激水平的影響

表4 KOS對大鼠氧化應激水平的影響Table 4 Effect of KOS on oxidative stress levels of rats

如表4所示，與NC組相比，DC組的T-AOC、GSH-Px活力、T-SOD活力顯著降低（P＜0.05），MDA濃度顯著增加（P＜0.05），這說明糖尿病可使脂質過氧化及氧自由基損傷程度加劇。KOS干預后，KOS低、高劑量組大鼠的抗氧化水平與DC組相比均得到改善，且能達到或高于NC組正常水平。MDA濃度作為脂質過氧化指標之一，可反映機體內脂質過氧化的程度，KOS干預后H-KOS組大鼠的MDA濃度與DC組相比顯著降低。結果表明，KOS在一定程度上可抑制脂質的過氧化，減少細胞受氧自由基的損傷，提高糖尿病大鼠的抗氧化應激能力。

2.5 糖代謝、脂代謝、氧化應激相關基因表達量分析

2.5.1 KOS對大鼠糖代謝相關基因mRNA表達水平的影響

為進一步了解KOS調節血糖濃度的分子機制，利用逆轉錄qPCR技術研究了大鼠肝臟中與糖代謝相關基因的表達水平，結果如圖3所示。KOS干預后，與DC組相比，KOS低、高劑量組糖原合成基因GS2、GYG1的表達量顯著上升，糖異生基因G6PC1的表達量顯著降低，INS誘導基因Insig1、Insig2的表達量顯著上升，且均高于NC組，其中H-KOS組Insig2表達量上調至接近NC組的10 倍。這表明KOS干預后能促進糖原的合成，抑制糖異生過程，誘導INS的合成和分泌，進而降低血糖濃度。

圖3 KOS對大鼠糖代謝相關基因表達水平的影響Fig. 3 Effect of KOS on the expression of genes associated with glucose metabolism

2.5.2 KOS對大鼠脂代謝相關基因mRNA表達水平的影響

圖4 KOS對大鼠脂代謝相關基因表達水平的影響Fig. 4 Effect of KOS on the expression of genes associated with lipid metabolism

表3數據顯示，KOS干預可顯著改善糖尿病大鼠的血脂組成，為了進一步研究KOS改善血脂的分子機制，利用逆轉錄qPCR技術研究了大鼠肝臟中與脂代謝相關基因的表達水平，結果如圖4所示。ACC、FAS參與脂肪酸的合成[17]，SREBP-1主要促進TG的合成。KOS干預后，與DC組相比，KOS低、高劑量組ACC、FAS、SREBP-1基因表達顯著下調，其中H-KOS組中FAS的表達量下調60%以上，這說明KOS干預可抑制脂肪酸、膽固醇和TG的生物合成路徑，改善糖尿病大鼠的血脂組成，緩解糖尿病癥狀。

2.5.3 KOS對大鼠氧化應激相關基因mRNA表達水平的影響

如圖5所示，KOS干預后，與DC組相比，KOS低、高劑量組Hmox1、Egfr基因表達量顯著上調，其中L-KOS組中Egfr基因表達量上調超過2 倍，H-KOS組上調4 倍；L-KOS組中Hmox1的表達量高于H-KOS組，且接近DC組的4 倍。IGFBP-1基因表達量顯著降低。

圖5 KOS對大鼠氧化應激相關基因表達水平的影響Fig. 5 Effect of KOS on the expression of genes associated with oxidative stress

3 討 論

本實驗以SD雄性大鼠為研究對象，尾靜脈注射STZ誘導糖尿病模型。探討KOS對糖尿病大鼠糖脂代謝及氧化應激水平的影響。

結果表明，與NC組相比，糖尿病可使大鼠體質量減輕、空腹血糖濃度升高。與DC組相比，KOS干預治療可有效增加糖尿病大鼠的體質量（H-KOS組體質量增加32.05%），顯著降低其空腹血糖濃度，這說明KOS對糖尿病大鼠的治療起到了積極的作用。糖尿病會導致大鼠血液中T-CHO、TG和LDL-C的含量增加，并使HDL-C含量顯著降低，進而導致血脂代謝紊亂[18-19]。KOS干預后，與DC組相比，大鼠血清中T-CHO、TG和LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著升高。這說明KOS可調節糖尿病大鼠的脂質代謝紊亂，進而緩解糖尿病癥狀。此外，KOS可提高機體的INS水平，進而改善血糖濃度。

有研究表明，糖尿病糖脂代謝紊亂會打破過氧化和抗氧化之間的平衡，從而降低機體抗氧化能力[20]。而自由基的形成和機體的天然抗氧化能力不平衡被認為是誘發糖尿病的根源[21]。GSH-Px能特異地催化還原型谷胱甘肽對氫過氧化物的還原反應，從而保護細胞膜結構和功能的完整。MDA的含量可直接反映機體內脂質的過氧化程度。T-SOD是促氧化-抗氧化平衡中至關重要的酶。糖尿病會顯著降低大鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px活力，增加MDA含量，增強氧化應激對機體的損傷。KOS干預后，與DC組相比，KOS低、高劑量組大鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px活力顯著提高，MDA濃度降低，說明KOS能抑制糖尿病引起的機體氧化應激損傷。

為了進一步研究KOS調節糖尿病大鼠糖脂代謝和氧化應激的分子機制，通過逆轉錄qRCR分析了與糖脂代謝及氧化應激相關基因的表達水平。GS2是谷氨酰胺合成酶，谷氨酰胺含量的增加能促進糖原的合成[22]，GYG1同樣也可以促進糖原的合成。KOS干預后，相對于DC組，KOS低、高劑量組大鼠GS2的表達量上升，其中L-KOS組上調了0.35 倍，優于H-KOS組。這說明KOS可促進肝糖原的合成，降低血糖濃度。G6PC1是糖異生最終反應的關鍵調控酶[23]，KOS干預后，相對于DC組，H-KOS組中G6PC1的表達量下調了0.53 倍，因此大鼠血糖濃度的下降也可能與糖異生的抑制有關。Insig1、Insig2是INS誘導基因，不但在糖代謝平衡中具有重要作用[24]，同時也能調節膽固醇和脂類代謝[12]。KOS干預后，相對于DC組，2 種INS誘導基因的表達量均顯著上調，其中H-KOS組中Insig1表達量上調1 倍，Insig2表達量上調9 倍。Insig1或Insig2的過度表達也可抑制肝臟中SREBP-1蛋白的活化，減少機體內的脂質沉積[25-26]，這與低、高劑量KOS干預后大鼠SREBP-1表達量顯著降低的結果一致。此外，ACC和FAS的表達也與SREBP-1有關，SREBP-1是內質網上與脂代謝相關的基因，主要促進TG的合成，激活后可促進FAS、ACC基因的過量表達，最終增加脂質沉積量[27-28]。KOS干預后，與DC組相比，KOS低、高劑量組中FAS、ACC的表達量顯著下調，其中FAS的下調量超過60%。這說明KOS干預可抑制脂肪酸、膽固醇和TG的生物合成路徑，從而改善糖尿病大鼠的血脂組成。Egfr的高表達量能顯著改善糖尿病大鼠的病理癥狀，提高機體的抗氧化能力[29]。KOS干預后，相對于DC組，H-KOS組中Egfr表達量上調4 倍。IGFBP-1是能與胰島素樣生長因子結合的調節蛋白，能夠競爭性抑制其與受體的結合，從而抑制其生理活性[30]。KOS干預后能顯著降低KOS低、高劑量組大鼠IGFBP-1表達量。另外，KOS干預也可使Hmox1表達量顯著上升。說明KOS可通過增加Egfr、Hmox1的表達量提高糖尿病大鼠機體的抗氧化能力。

綜上所述，KOS可通過促進糖原合成和抑制糖異生來調節大鼠血糖濃度，并且通過抑制脂肪酸、膽固醇和TG的生物合成途徑來調節脂質代謝，抑制糖尿病引起的氧化應激損傷，增強機體的抗氧化能力。