長白山核桃源五肽對過氧化氫誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用及機理

郭 勇，秦漢雄，魏 貞，方 麗，閔偉紅*

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118 ）

長白山核桃（Juglans mandshuricaMaxim）屬于落葉闊葉喬木樹種，核桃仁中含有18 種氨基酸，其中8 種必需氨基酸含量豐富，其效價與動物蛋白接近，是一種天然的優質蛋白[1-2]。食源性生物活性肽是蛋白質經蛋白酶水解后所得的一系列不同分子質量肽段，這些肽段所表現出來的生理活性存在差異[3]，其生理活性包括預防癌癥[4]、調節免疫[5]、降血壓[6]、減肥[7]、降膽固醇[8]和提高記憶力[9]等。

氧化應激是由于體內氧化系統與抗氧化系統作用失衡，使體內產生過多高活性分子，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）等，從而造成組織損傷[10]。研究認為，氧化應激廣泛參與衰老[11]、炎癥[12]、糖尿病[13]、神經退行性疾病[14]和心腦血管[15]等多種病理生理過程。氧化應激產生的自由基是幾種疾病實驗模型的共同特征之一，氧化應激產生的自由基影響神經細胞的結構和功能，進而導致廣泛的神經退行性疾病，包括帕金森病和阿爾茨海默病等[16]。PC12細胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的細胞株，具備神經細胞的特性，其可被神經生長因子（nerve growth factor，NGF）誘導分化成神經元形態，廣泛用于神經退行性疾病的研究[17]。

本實驗室前期的工作中，通過對核桃粕分離蛋白進行堿性蛋白酶定向水解、超濾、Sephadex G-25、Sephadex G-15和反相高效液相色譜分離純化后，經電噴霧串聯質譜儀鑒定出分子質量為610.416 6 Da的核桃源五肽Leu-Pro-Leu-Leu-Arg（LPLLR），本實驗在此基礎上，對核桃源五肽進行過氧化氫誘導PC12細胞的保護作用及機理研究，為核桃抗氧化肽保護神經細胞的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LPLLR（分子質量610.416 6 Da，純度99.75%）北京中科亞光生物科技有限公司。

噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；NO、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、ROS和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙酰膽堿（acetylcholine，ACh） 美國Research and Development公司；SOD2、誘導型一氧化氮合酶（iducible nitricoxide synthase，iNOS）、核轉錄因子κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）、肌動蛋白（β-actin） 美國Cell Signaling Technoloy公司；牛（脫脂）乳粉 科邁生物化學有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

RSA224S型分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；CB150型CO2培養箱 德國Binder公司；AE31倒置顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；SPECTRA-MAX190型酶標儀 美國Molecular Devices公司；Z36HK高速冷凍離心機 德國Hermle公司；UV-1700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；IX53熒光倒置顯微鏡日本Olympus公司；ImageQuant LAS500凝膠成像系統上海通用電氣醫療集團；1703940型半干式電轉儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 LPLLR對過氧化氫誘導PC12細胞氧化應激的影響

1.3.1.1 PC12細胞培養及傳代

將PC12細胞培養瓶置于37 ℃、5% CO2培養箱中，待其生長穩定后，進行繼續培養（細胞培養液含90 mL 1640培養液、10 mL胎牛血清、2 mL雙抗），細胞傳代，細胞凍存（細胞凍存液中1640培養液、胎牛血清、DMSO體積比為7∶2∶1）處理。選擇生長狀態良好4～9 代細胞進行實驗。

1.3.1.2 MTT法檢測LPLLR對PC12細胞的毒性

細胞的分組處理：PC12細胞調整濃度為4×105個/mL，每孔100 μL接種于96 孔培養板，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，設空白組（未經任何處理）和樣品組（LPLLR終濃度為25、50、100、200 μmol/L），于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，加入MTT溶液（終質量濃度為5 mg/mL），繼續培養4 h后，棄去培養液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min至甲瓚結晶完全溶解，酶標儀測OD490nm，其中空白組記為OD0，樣品組記為OD1。樣品組細胞存活率按下式計算。

1.3.1.3 PC12細胞過氧化氫誘導氧化應激損傷模型的建立

細胞培養同1.3.1.2節，設空白組（未經任何處理）和模型組（過氧化氫終濃度為100、200、300、400、500 μmol/L）于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養1、2、3、4、5 h后，加入MTT溶液（終質量濃度為5 mg/mL），繼續培養4 h后，棄去培養液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min至甲瓚結晶完全溶解，用酶標儀測OD490nm，其中空白組記為OD0，模型組記為OD1。模型組細胞存活率按1.3.1.2節公式計算。

1.3.1.4 LPLLR對過氧化氫誘導PC12細胞氧化應激的保護作用

細胞培養同1.3.1.2節，設空白組（未經任何處理）、模型組（僅過氧化氫處理）、樣品組（過氧化氫+LPLLR，其中低、中、高濃度組LPLLR濃度分別為25、50、100 μmol/L）。在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，加入各樣品100 μL孵育18 h后，加入終濃度300 μmol/L的過氧化氫繼續孵育2 h，加入MTT溶液（終質量濃度為5 mg/mL）繼續培養4 h，棄去培養液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min至甲瓚結晶完全溶解，用酶標儀測OD490nm，其中空白組記為OD0，實驗組（模型組及樣品組）記為OD1。實驗組細胞存活率按1.3.1.2節公式計算。

1.3.1.5 LPLLR對氧化損傷PC12細胞內ROS水平的影響

細胞培養及分組同1.3.1.2節，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，分別加入終濃度為25、50、100 μmol/L的樣品100 μL孵育18 h后，加入終濃度為300 μmol/L的過氧化氫繼續孵育2 h，棄去孔內液體，按照試劑盒說明進行操作，以相對熒光強度表示細胞內ROS水平。

1.3.1.6 LPLLR對氧化損PC12細胞內SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA、NO、ACh含量的影響

細胞的分組處理：PC12細胞調整密度為4×105個/mL，每孔800 μL接種于6 孔培養板，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，分別加入終濃度為25、50、100 μmol/L的樣品100 μL孵育18 h后，加入終濃度為300 μmol/L的過氧化氫繼續孵育2 h，棄去過氧化氫刺激的細胞培養液后，用滅菌的磷酸鹽緩沖液清洗2 次，加入100 μL細胞裂解液，待細胞完全裂解完畢后吸入1.5 mL的EP管中，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，吸上清液待測。按試劑盒說明書測定SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA、NO、ACh含量。

1.3.2 Western blotting法檢測定PC12細胞中SOD2、NF-κB和iNOS蛋白表達水平

細胞處理方法同1.3.1.6節，用BCA蛋白質量濃度測定試劑盒測定蛋白質量濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，采用半濕法使目的蛋白電轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用質量分數5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST洗膜3 次，每次10 min。將PVDF膜放入含質量分數3%脫脂奶粉的SOD2、NF-κB和iNOS的抗體稀釋液中（體積比1∶1 000稀釋），4 ℃過夜孵育；TBST洗膜3 次，每次10 min。二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜3 次，每次10 min。用增強化學發光試劑顯色后于凝膠成像儀中曝光拍照。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 LPLLR的質譜分析結果

圖1 LPLLR的質譜圖Fig. 1 Mass spectrum of LPLLR

圖1 為經電噴霧串聯質譜儀鑒定出LPLLR的質譜圖，其分子質量為610.416 6 Da，并由北京中科亞光生物科技有限公司進行化學合成（純度99.75%）。

2.2 MTT細胞毒性實驗結果

圖2 不同濃度的LPLLR對PC12細胞存活率的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of LPLLR on survival rates of PC12 cells

MTT法是一種廣泛應用于檢測細胞增殖、生存能力和藥物毒性的方法，其檢測原理為活細胞中的氧化還原酶使MTT還原為不溶性物質甲瓚沉淀于細胞內，生成的甲瓚結晶溶于DMSO，在490 nm波長處有最大吸收峰[18]。由圖2可知，與空白組相比，LPLLR的濃度為25、50、100 μmol/L時，PC12細胞活力沒有顯著差異，說明在此濃度下對細胞無毒性作用，對PC12細胞生長繁殖無影響。但在LPLLR的濃度為200 μmol/L時，對PC12細胞活力有顯著的抑制作用（P＜0.05）。因此，選取樣品濃度為25、50、100 μmol/L進行后續實驗。

2.3 PC12細胞氧化損傷模型建立

如圖3所示，當過氧化氫濃度小于200 μmol/L時，對PC12細胞損傷不明顯，細胞存活率在70%以上；當濃度大于300 μmol/L時，過氧化氫對PC12細胞損傷明顯，隨著濃度增加和刺激時間延長，細胞存活率降低，當刺激時間達到5 h后，細胞存活率降到10%以下。本實驗主要研究LPLLR肽段在自然衰老模型中對神經細胞的保護作用，因此選取300 μmol/L過氧化氫刺激2 h建立損傷模型。

圖3 不同過氧化氫濃度和作用時間對PC12細胞存活率的影響Fig. 3 Effects of different hydrogen peroxide concentrations and treatment time on survival rates of PC12 cells

2.4 LPLLR對過氧化氫誘導PC12細胞氧化應激的保護作用

圖4 LPLLR對過氧化氫誘導PC12細胞氧化應激損傷模型的保護作用Fig. 4 Protective effect of LPLLR on PC12 cells against H2O2-induced oxidative injury

MTT法檢測LPLLR對過氧化氫誘導PC12細胞氧化應激模型的保護作用，如圖4所示，與空白組相比，模型組的細胞存活率高度顯著降低（P＜0.001），說明模型構建成功。經LPLLR刺激后，各組細胞存活率隨著LPLLR濃度的增加而逐漸升高，呈濃度依賴關系，說明LPLLR對氧化應激損傷的PC12細胞具有有效的保護作用。

2.5 LPLLR對PC12細胞內ROS水平的影響

圖5 LPLLR對PC12細胞內ROS水平的影響Fig. 5 Effect of LPLLR on ROS level in PC12 cells

如圖5所示，與空白組相比，模型組中ROS的相對熒光強度高度顯著升高（P＜0.001），說明模型構建成功。與模型組相比，添加LPLLR的實驗組中ROS的相對熒光強度均顯著降低（P＜0.001，P＜0.05），說明LPLLR能降低氧化損傷PC12細胞內的ROS水平。

2.6 LPLLR對PC12細胞內MDA含量的影響

圖6 LPLLR對PC12細胞內MDA含量的影響Fig. 6 Effect of LPLLR on MDA content in PC12 cells

LPLLR保護PC12細胞氧化應激損傷模型中MDA含量的變化，如圖6所示。與空白組相比，模型組中MDA的含量高度顯著大于空白組（P＜0.001），說明模型構建成功。與模型組相比，添加LPLLR的實驗組中除低濃度組外，中濃度和高濃度組的MDA含量均顯著降低（P＜0.05）。

2.7 LPLLR對PC12細胞內SOD、CAT和GSH-Px活力的影響

表1 LPLLR對PC12細胞內SOD、CAT和GSH-Px活力的影響Table 1 Effect of LPLLR on SOD, CAT and GSH-Px activity in PC12 Cells

由表1可知，與空白組相比，模型組SOD、CAT和GSH-Px的活力均高度顯著下降（P＜0.001）；與模型組相比，添加LPLLR的實驗組SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著提高（P＜0.001，P＜0.05）。由此表明，LPLLR能夠增加PC12中SOD、CAT和GSH-Px的活力。

2.8 LPLLR對PC12細胞內ACh含量的影響

如圖7所示，與空白組相比，模型組中ACh含量高度顯著降低（P＜0.001），說明模型構建成功。與模型組相比，PC12細胞中ACh含量都隨LPLLR濃度的增加而增加，呈濃度依賴性，其中，中濃度和高濃度組與模型組存在顯著差異（P＜0.05）。

圖7 LPLLR對PC12細胞中ACh含量的影響Fig. 7 Effect of LPLLR on ACh content in PC12 cells

2.9 LPLLR對PC12細胞內NO濃度的影響

圖8 LPLLR對PC12細胞中NO濃度的影響Fig. 8 Effect of LPLLR on the production of NO in PC12 cells

如圖8所示，與空白組相比，模型組的NO濃度高度顯著上升（P＜0.001）；與模型組相比，LPLLR實驗組的NO濃度均高度顯著下降（P＜0.001）。

2.10 LPLLR對PC12細胞中SOD2、NF-κB p65和iNOS蛋白表達的影響

如圖9所示，與空白組相比，模型組中SOD2蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，LPLLR低、中、高濃度組中SOD2蛋白相對表達量均顯著升高（P＜0.001，P＜0.05）。與空白組相比，模型組中iNOS和細胞質NF-κB p65蛋白相對表達量均高度顯著升高（P＜0.001）。與模型組相比，LPLLR各濃度組中iNOS和細胞質NF-κB p65蛋白相對表達量均顯著下降（P＜0.001，P＜0.05）。

圖9 LPLLR對PC12細胞中SOD2（A）、NF-κB p65（B）和iNOS（C）蛋白表達的影響Fig. 9 Effect of LPLLR on protein expression of SOD2 (A),NF-κB p65 (B) and iNOS (C) in PC12 cells

3 討 論

氧化應激是導致機體衰老的關鍵因素，會對中樞神經系統造成直接傷害，主要是由于中樞神經細胞耗氧量大但抗氧化水平相對較低，神經元處于氧化應激高風險中[19-20]。通常情況下，ROS與機體內抗氧化系統協調維持穩態，所以少量的ROS不會對機體造成損傷。但當ROS大量積累時，抗氧化系統不能抵御ROS，機體內發生氧化應激，使脂質過氧化進而損傷神經細胞。本研究中，LPLLR能明顯提高氧化損傷PC12細胞的存活率，降低細胞中ROS水平，呈濃度依賴關系。有文獻報道其他食源性生物活性多肽對氧化損傷的PC12細胞具有保護作用，如美國肉參膠原蛋白肽I1在100 μg/mL時可使氧化損傷PC12細胞的存活率提高68.8%[21]；脫脂麥胚蛋白肽在1 mg/mL時可使氧化損傷PC12細胞的存活率提高33%[22]；花生蛋白肽[23]和金華火腿肽[24]對氧化損傷的PC12細胞具有良好的保護作用。與這些食源性生物活性肽相比，LPLLR的保護作用更加明顯，其原因可能是LPLLR肽段中疏水性氨基酸所占比例為80%，并且末端含有堿性氨基酸R，所以同濃度下，LPLLR的效果更好。研究表明，序列中含有疏水性氨基酸的肽段抗氧化活性較高，而堿性氨基酸R可作為電子受體，奪取氧化所形成自由基的電子從而阻斷氧化反應[25-26]。

機體內抗氧化系統主要包括酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統，酶抗氧化系統主要包括SOD、CAT和GSH-Px；非酶抗氧化系統主要包括類胡蘿卜素、Zn和Se等。酶抗氧化系統往往與非酶抗氧化系統聯合發揮抗氧化作用，例如SOD常與非酶抗氧化因子Cu、Zn和Mn結合形成酶復合物Cu-SOD、Zn-SOD和Mn-SOD[27-29]。在機體中SOD存在3 種形式：SOD1存在于細胞質中，SOD2存在于線粒體中，SOD3存在于細胞外。本研究，LPLLR能顯著提高PC12細胞內SOD、CAT和GSH-Px活力。ROS主要由線粒體產生，因此本實驗采用Western blotting法分析SOD2在PC12細胞中蛋白表達情況，結果表明LPLLR能提高PC12細胞內SOD2含量。實驗結果與Jia Ji等[30]的研究結果相一致，能提高細胞內SOD、CAT和GSH-Px活力，以及提高細胞內SOD2蛋白表達含量。

研究表明，ROS可以增強IκB激酶復合物NEMO的Cys54和Cys347二聚化，從而激活NF-κB[31]。NF-κB是以p50/p65異二聚體的形式存在于細胞漿中，其激活可以誘導許多因子如iNOS、環氧合酶2和Mn-SOD等轉錄。iNOS被激活后催化L-精氨酸末端胍基中的一個氮原子氧化而合成大量NO，NO可以與超氧陰離子反應生成超氧亞硝酸陰離子，并進一步分解為羥自由基和NO2等自由基，使神經細胞產生神經毒性，最終導致細胞凋亡。此外，高濃度NO通過抑制多種與線粒體電荷傳遞和檸檬酸循環有關的酶，來抑制線粒體呼吸作用，使神經細胞受到損傷。本研究采用Western blotting法分析PC12細胞中NF-κB p65和iNOS蛋白表達情況，以及用酶聯免疫吸附檢測法測定細胞中NO含量。結果表明，模型組中過氧化氫能上調NF-κB p65和iNOS蛋白表達，增加NO分泌量；實驗組中LPLLR能下調NF-κB p65和iNOS蛋白表達，降低NO分泌量。說明LPLLR可能通過抑制NF-κB/iNOS/NO信號通路對過氧化氫誘導PC12細胞進行保護作用。

綜上所述，LPLLR對氧化應激損傷的PC12細胞具有一定的保護作用，主要是通過提高酶抗氧化系統中抗氧化酶的活力和抑制NF-κB/iNOS/NO信號通路發揮作用。