可溶性大豆多糖改善左旋肉堿誘導的小鼠小腸首過代謝

李文峰，陶 雯，陳露紅，鄭俏然，周 鳳，譚 飔，邢 潔

（長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶 408000 ）

左旋肉堿是紅肉的一種固有成分，主要存在于雜食者的飲食中[1]。目前，它的推薦攝入量從1 g/d增加到3 g/d[2]。左旋肉堿屬于類維生素，與動物體內的脂肪酸代謝密切相關[3]，以左旋肉堿作為膳食補充劑可以調節脂肪肝患者血脂濃度，降低肝酶活性，改善肝脂肪變性，減輕患者體質量[4]。雖然左旋肉堿的短期攝入確實會有效降低體質量，但是長期攝入會改變小鼠盲腸微生物構成，顯著提高小鼠體內三甲胺和氧化三甲胺的合成，從而增加小鼠患動脈粥樣硬化的風險[5]。此外，先前的研究結果表明，連續10 周灌胃質量分數3%左旋肉堿水溶液會導致小鼠出現肌肉萎縮和肝臟損傷[6]。尤其是長期口服左旋肉堿會加速活性氧（reactive oxygen species，ROS）在血清和肝臟中的產生，并削弱超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化酶的活性[2,6]，表明左旋肉堿的長期攝入會導致氧化應激。氧化應激水平的升高可上調P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和其他ATP結合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）式轉運體的過度表達，繼而誘發強烈的首過代謝[7]。首過代謝是指口服藥物經胃、腸道吸收后，經門靜脈輸送至肝臟代謝滅活，導致進入血液循環的有效藥量顯著減少的現象，它與P-gp、多藥耐藥蛋白（multidrugresistant protein，MRP）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶（uridine diphosphate-glucuronosyltransferase，UGT）和磺酸基轉移酶（sulfotransferase，SULT）等外排轉運泵及II相代謝酶緊密相關[8]。腸道組織過度表達外排轉運泵及II相代謝相關蛋白意味著藥物或外源性營養成分遭受了嚴重的首過代謝，導致生物利用度降低[9]。就此推測，左旋肉堿可能會影響小腸的外排轉運蛋白等首過代謝相關蛋白的表達。已有研究發現，黃芪和靈芝多糖能夠調控細胞對P-gp和多藥耐藥性相關蛋白的表達，從而拮抗藥物的首過代謝[10-11]。

可溶性大豆多糖（soybean soluble polysaccharides，SSPS）是一種酸性多糖，主鏈由聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸聚糖組成，側鏈是β-1,4-半乳聚糖，支鏈具有果糖和阿拉伯糖殘基[12]，它作為抗氧化劑可以防止腎上皮細胞的氧化損傷[13]。本研究旨在探究長期過度攝入左旋肉堿對腸組織首過代謝、氧化應激和炎性反應的影響，并考查SSPS的健康保護作用。以期為合理攝入左旋肉堿提供科學依據，為拓展大豆可溶性多糖的應用領域提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康昆明種雄性小鼠（體質量20～25 g，動物生產許可證號：XJYYLL-2015689）、標準鼠糧 第四軍醫大學實驗動物中心；左旋肉堿（食品級） 西安萬昌生物科技有限公司；SSPS 上海生物技術蔬菜蛋白有限公司；酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒 上海酶聯生物技術有限公司；SOD試劑盒、羥自由基（·OH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙腈、甲酸乙酯（色譜級） Adamas試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

F10均質機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）儀 北京Bruker公司；LDZ5-2臺式自動平衡離心機 常州恒隆有限公司；UPLC系統美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

小鼠被飼養在有光和溫度控制的動物實驗室（12 h/12 h光/暗周期、（22±2）℃）。在為期1 周的適應性喂養期間，小鼠可攝入自來水和正常食物。適應喂養期后隨機分為3 組，每組8 只。正常組：小鼠每天攝入自來水，灌胃0.4 mL生理鹽水；左旋肉堿組：小鼠每天攝入3%（質量分數，下同）左旋肉堿水溶液，灌胃0.4 mL生理鹽水；SSPS組：小鼠每天攝入3%左旋肉堿水溶液，灌胃0.4 mL 250 mg/kg SSPS[14]。所有操作均在19∶00～20∶00進行，灌胃實驗連續進行56 d，每隔1 d更新一次3%左旋肉堿水溶液，每周稱量一次小鼠的體質量。此外，在喂食期間，所有小鼠都允許自由攝入標準鼠糧。在最后一次灌胃2 h后，對所有小鼠采取禁食管理，12 h禁食期間允許攝入蒸餾水。用異氟烷將小鼠麻醉后處死，解剖后收集小鼠小腸。

1.3.2 小腸的生化分析和ELISA分析

將0.3 g小腸組織與2.7 mL生理鹽水混合后均質，3 000 r/min離心10 min[15]。按照ELISA試劑盒說明書測定上清液的P-gp、MRP1、MRP3、IL-1、IL-6、TNF-α質量濃度和UGT、SULT活力，按試劑盒說明書測定MDA濃度、SOD活力和·OH清除能力。

1.3.3 小腸內容物代謝物含量分析

將小腸切開，用生理鹽水清洗，收集小腸內容物。將100 μL小腸內容物與400 μL冷提取溶液（V（甲醇）：V（乙腈）：V（水）＝1∶1∶1）充分混合，3 000 r/min離心15 min后取上清液備用。將300 μL上清液和1 000 μL甲醇加入到1.5 mL離心管中，混勻后用0.22 μm聚偏二氟乙烯過濾，濾液采用UPLC-Q-TOF/MS儀進行分析。為了驗證儀器穩定性，將每個樣本等量混合，制成質量控制樣品[16]，將其隨機插入到真實樣品隊列中進行8 次分析[17]。進樣量為5 μL，采用AcclaimTMRSLC C18柱（100 mm×3.0 mm，2.2 μm）。UPLC條件：柱溫25 ℃，流速0.2 μL/min，用0.1%（體積分數，下同）甲酸（流動相A）和含有0.1%甲酸的乙腈（流動相B）進行梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0～5 min，95%～70%流動相A；5～10 min，70%～40%流動相A；10～15 min，40%～10%流動相A；15～18 min，10%流動相A；18～25 min，10%～95%流動相A；25～30min，95%流動相A。MS條件：毛細管加熱器和蒸發加熱器的溫度分別為220 ℃和450 ℃，在SCAN模式下采集m/z 50～1 000的離子信息，掃描速度為600 ms/cyc。干燥氣（流速8 mL/min）和碰撞氣均為氮氣，碰撞能量為10 eV。

1.3.4 UPLC-Q-TOF/MS數據分析

使用M a s s Ly n x軟件M e t a b o N e x u s程序對UPLC-Q-TOF/MS數據進行預處理[18]。將MetaboNexus中得到的數據矩陣通過一個樣本中所有代謝物的響應之和進行歸一化。用R軟件（https://www.r-project.org）對歸一化數據矩陣進行處理[19]。通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、有監督的偏最小二乘法分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和稀疏的PLS-DA（sparse PLS-DA，sPLS-DA）處理數據矩陣。采用sPLS分析生物標志物水平、抗氧化活性和ABC-轉運蛋白表達水平之間的相關性。采用Multi Experiment Viewer軟件（http://www.tm4.org/）進行單因素分析。以Benjamini-Hochberg方法為基礎的Kruskal-Wallis測試和錯誤發現率（false discovery rate，FDR）修正評估結果。z-值按照文獻[20]方法進行計算。根據與標準物的MS/MS圖和公共數據庫譜圖（包括HMDB數據庫（http://www.hmdb.ca/w/databases）、LipidomicsGateway數據庫（http://www.lipidmaps.org/）、KEGG數據庫（http://www.kegg.jp）和METLIN數據庫）進行對照以確定不同的代謝產物。

1.4 數據統計與分析

通過GraphPad Prism 6軟件作圖。利用SPSS軟件對數據進行Q-Q圖分析，判斷數據是否符合正態分布；若數據符合正態分布，則使用最小顯著性差異法進行多重比較分析；如果數據不符合正態分布，則采用非參的Kruscal-Wallis法進行統計分析，當存在顯著性差異時進一步采用Wilcoxon檢驗；P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SSPS對小鼠小腸內轉運蛋白的影響

圖1 SSPS對小鼠小腸內P-gp（A）、MRP1（B）、MRP3（C）質量濃度及SULT（D）、UGT（E）活力的影響Fig. 1 Effect of SSPS on P-gp (A), MRP1 (B) and MRP3 (C)concentrations, and SULT (D) and UGT (E) activities in the small intestine of mice

由圖1A可知，連續8 周灌胃質量分數3%左旋肉堿導致小鼠小腸P-gp質量濃度顯著增加了194%（P＜0.05），表明小鼠攝入過量左旋肉堿會引起強烈的外排轉運。但SSPS處理能將P-gp質量濃度從（1.62±0.82）ng/mL降低到（0.97±0.40）ng/mL（P＜0.05）。在8 周實驗后，攝入過量左旋肉堿的小鼠相對于正常小鼠的小腸組織MRP1（圖1B）和MRP3（圖1C）質量濃度分別增加了65%（P＞0.05）和55%（P＜0.05）。SSPS能使左旋肉堿組小鼠小腸的MRP1和MRP3質量濃度輕微降低（P＞0.05）。除外排泵轉運蛋白P-gp、MRP1和MRP3外，UGT和SULT也是誘導強烈首過代謝的關鍵蛋白。如圖1D、E所示，在不同處理組的小鼠小腸組織中SULT和UGT活力沒有明顯變化（P＞0.05）。因此，左旋肉堿和SSPS并不會通過誘導II相代謝酶表達而誘發強烈的首過代謝。

2.2 SSPS對小鼠小腸抗氧化能力的影響

圖2 SSPS對小鼠小腸SOD活力（A）、·OH清除能力（B）、MDA濃度（C）的影響Fig. 2 Effect of SSPS on SOD activity (A), hydroxyl radical scavenging activity (B) and MDA content (C) in the small intestine of mice

如圖2A所示，小鼠攝入質量分數3%左旋肉堿導致小腸SOD活力顯著下降（P＜0.05）。此外，左旋肉堿組小鼠小腸也具有更低的·OH清除能力（圖2B）。然而，連續8 周的SSPS處理可有效預防左旋肉堿誘導的SOD活力和·OH清除能力的降低。與正常組小鼠比較，攝入過量左旋肉堿小鼠小腸的MDA濃度從（0.96±0.14）nmol/mL顯著提高到（1.68±0.31）nmol/mL（P＜0.05）（圖2C）。SSPS組小鼠小腸的MDA濃度與左旋肉堿組小鼠相比降低了34%。因此，SSPS對過量左旋肉堿引起的氧化應激具有很強的保護作用。

2.3 SSPS對小鼠小腸內炎癥因子的影響

如圖3所示，3 組小鼠小腸的IL-1、IL-6和TNF-α質量濃度變化不顯著（P＞0.05），表明連續8 周攝入過量左旋肉堿或SSPS不會引起小腸的炎癥反應。

2.4 小鼠小腸內容物的代謝組學分析

圖4 正離子模式（A）和負離子模式（B）下小鼠小腸內容物的UPLC-Q-TOF/MS圖Fig. 4 Chromatograms of small intestinal contents in positive ion mode (A)and negative ion mode (B) obtained from ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry analysis

如圖4所示，在基于100%峰缺失值識別之后，從實際樣品中獲得了1 622 個正離子和508 個負離子，并且通過MetaboNexus軟件對出峰時間和m/z信息進行排列和對齊。為了減少假陽性結果，以質量控制數據集為標準，將峰面積相對標準偏差大于30%的代謝產物信息從數據集中去除[12]。最后得到1 209 個離子，包括798 個正離子和411 個負離子。

2.5 小鼠小腸內容物代謝標志物的鑒定結果

如圖5A所示，第1主成分將左旋肉堿組小鼠與正常組和SSPS組小鼠進行了判別，而第2主成分則區分了SSPS組小鼠與另外2 組小鼠。然而，PCA的第3主成分并不能判別不同的膳食對小鼠小腸內容物代謝指紋圖譜的影響。此外，由PCA得分圖可知，第1主成分和第2主成分可累計解釋44%的變量。因此，進一步的sPLS-DA選擇了2 個主成分為預測距離篩選參數。采用中心距離時sPLS-DA具有最小標準偏差，故在正式的sPLS-DA中采用中心距離和2 個主成分。在sPLS-DA得分圖（圖5B）中，正常組、左旋肉堿組小鼠和SSPS組小鼠之間有明顯的區別。據此篩選出的6 種代謝物的sPLS-DA得分圖如圖5C所示，它們與其他代謝物相比具有更大的自變量投影重要性指標（variable importance in projection，VIP）和載荷值（圖5D），表明這6 種代謝物對3 組小鼠的區分具有更重要的價值。為了更準確地確定潛在生物標志物，本實驗分析了基于z-值的FDR，結果表明支鏈淀粉可能是假陽性結果（P＞0.05），因此將其從候選池中移除（圖5E）。最終確定了5 個潛在生物標志物，它們分別為1,2-雙-(二十四烯酰)-丙三基-3-膽堿磷酸（PC(24∶1/24∶1)）、1-(二十碳五烯酰)-2-(十九烷基)-丙三基-3-磷酸-(1’-甘油)（PG(20∶5/19∶0)）、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(二十碳五烯酰)-2-(二十碳四烯酰)-丙三基-3-膽堿磷酸（PC(20∶5/20∶4)）和N(Omega)-(ADP-D-核糖基)-L-精氨酸。

圖5 小鼠小腸內容物代謝指紋圖譜的多元變量分析Fig. 5 Multivariate analysis of intestinal metabolite fi ngerprints

2.6 差異物關系以及與首過代謝關系

圖6 生物標志物的關系圖Fig. 6 Relationship among biomarkers

如圖6所示，長期過量攝入左旋肉堿引起了磷脂酰甘油、卵磷脂和sn-甘油-3-磷酸乙醇胺3 種脂質的代謝變化，表明小鼠腸道的能量代謝發生了紊亂。

圖7 左旋肉堿和SSPS處理小鼠的代謝組學結果（A）和生化分析結果（B）相關性Fig. 7 Correlation between metabonomic (A) and biochemical analysis (B)of L-carntine and SSPS-treated mice

SSPS處理可將左旋肉堿喂養小鼠體內的脂質和能量代謝維持在正常水平（圖7A）。如圖7B所示，sPLS分析表明MDA濃度與P-gp質量濃度、PC(24∶1/24∶1)與PG(20∶5/19∶0)、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、PC(20∶5/20∶4)含量具有很好的正相關性。同時MRP3質量濃度與P-gp質量濃度、MDA、PC(24∶1/24∶1)、PG(20∶5/19∶0)、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、PC(20∶5/20∶4)含量之間也存在一定的正相關關系。此外，P-gp質量濃度、MDA、PC(24∶1/24∶1)、PG(20∶5/19∶0)、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、PC(20∶5/20∶4)含量分別與·OH清除能力和SOD活力呈負相關。

3 討 論

左旋肉堿作為紅肉中的固有成分，一直以來被推崇為一種特效減肥食品[1,21]。然而，近年來一些研究發現，長期攝入高劑量的左旋肉堿會導致腎臟代謝壓力[22]。SOD活力和·OH清除能力被廣泛用于反映體內的氧化應激狀態[13,23]；MDA作為一種脂質氧化產物，具有比ROS更長的半衰期，且能顯著增強體內氧化應激的水平[24]。與先前研究結果[2,4]類似，攝入過量左旋肉堿導致小鼠小腸SOD活力以及·OH清除能力減弱，MAD含量顯著增加，表明左旋肉堿確實可以誘導氧化應激。值得注意的是，目前的研究結果表明SSPS作為重要的食物抗氧化劑可有效抑制左旋肉堿誘導的小鼠小腸氧化應激[13]。體內氧化應激水平的提升可誘導外排泵轉運蛋白和II相代謝酶的過度表達，繼而引發強烈的首過代謝，導致食品成分或藥物的生物利用度降低[9]。

P-gp是人和嚙齒動物體內藥物外排轉運體ABC家族中最重要的成員，在人體內由MDR1基因編碼[25]，是參與藥物首過效應的主要轉運體[26]。P-gp的過度表達會導致外源性活性成分的II相代謝產物被迅速排出，從而使其生物利用度降低，導致營養成分功效下降[27]。本研究發現，長期過量攝入左旋肉堿導致小鼠小腸P-gp質量濃度顯著增加，表明左旋肉堿強化了首過代謝。SSPS有效抑制了左旋肉堿誘導的P-gp質量濃度的增加，說明SSPS可以抑制首過代謝的外排轉運通路，從而有助于提升營養成分的生物利用度。

營養物質在遭受外排轉運前，會先在UGT和SULT等II相代謝酶的作用下發生II相生物轉化，生成水溶性更高的葡萄糖醛酸化和磺酸化代謝產物以便轉運[28-29]。無論是長期攝入過量的左旋肉堿還是同時攝入SSPS與左旋肉堿均不能改變小鼠小腸的SULT和UGT活力，因此，左旋肉堿和SSPS對首過代謝過程的II相代謝基本沒有影響。

雖然氧化應激也可誘導脂質過氧化反應繼而刺激炎癥因子的形成和釋放[30-31]，但左旋肉堿和SSPS處理均未引起小鼠小腸中標志性炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α質量濃度的顯著變化。氧化應激除了引起強烈的首過代謝和炎癥外，也可導致體內脂質代謝的紊亂。大量研究表明，長期口服攝入大劑量的左旋肉堿會導致肝臟脂質代謝與血脂代謝的失衡[3]。本研究中代謝組學分析結果表明，左旋肉堿引起了小鼠腸道能量及脂質代謝的紊亂，且這種紊亂與氧化應激參數MDA濃度及抗氧化活性間存在著一定的正相關關系。SSPS可維持左旋肉堿組小鼠小腸代謝的穩態，這或許是其抑制氧化應激水平提升的原因。因此，SSPS可能是一種能有效預防長期攝入左旋肉堿導致副作用的膳食營養因子。