家禽屠宰場微生物菌群結構及大腸桿菌耐藥性評估

王佩佩，戴賢君，楊 華，肖英平,*

（1.中國計量大學生命科學學院，浙江 杭州 310018 ；2.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021 ；3.浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021 ）

肉雞在屠宰加工生產鏈中易受到微生物的污染，如各屠宰區域的水、屠宰設備中微生物的交叉污染，從而增加雞肉的微生物污染水平[1]。屠宰場環境中存在的腐敗菌會影響雞肉品質和貨架期，一些致病菌威脅著人類的健康[2]。肉雞在屠宰過程中的產生物如血、毛、糞便等廢棄物可能含有耐藥基因，將直接污染屠宰場區域的水體和地面，未經處理排放入環境中還可能會污染周邊水體和土壤。因此家禽屠宰場的微生物分布狀況不僅直接影響雞肉的質量安全，也關系到生態環境和人類健康。目前國內外對肉雞的屠宰加工過程中特定食源性致病菌的研究較多，如James等[3]發現肉雞屠宰加工生產鏈中存在單核細胞增生李斯特菌、彎曲桿菌、沙門氏菌、糞便梭菌等病原微生物，但對檢出率較高的大腸桿菌污染溯源以及易造成雞肉微生物交叉污染的家禽屠宰場區域水體、地面以及屠宰器械表面微生物結構和耐藥基因研究較少。本研究基于16S rRNA V3～V4的Illumina高通量測序方法，分析家禽屠宰場不同區域水體、地面和屠宰器械表面微生物結構特征，并從中分離大腸桿菌，通過VITEK2進行耐藥性評估，應用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測磺胺類、喹諾酮類和四環素類基因等9大類耐藥基因，為全面、準確地認識家禽屠宰場環境微生物多樣性、耐藥基因傳播擴散與環境風險間的關系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

緩沖蛋白胨水、平板計數瓊脂培養基、孟加拉紅培養基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose，LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯、麥康凱培養基、伊紅-美藍瓊脂培養基、LB瓊脂、LB肉湯 杭州微生物試劑有限公司；氯化鈉 浙江常青化工有限公司；ex-Taq聚合酶、loading buffer、DL5000 DNA Marker 大連寶生物公司。

1.2 儀器與設備

CF 16RXII高速低溫離心機 日本Hitachi公司；YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；PL202-L電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；生物安全柜山東博科生物產業有限公司；-80 ℃超低溫冰箱美國Thermo公司；VTTEEK微生物自動鑒定儀 法國梅里埃公司；檢測卡（GNI）和藥敏卡（GN-AST）杭州怡丹生物技術有限公司；PCR儀 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 屠宰區域水體微生物樣品采集

選擇浙江省某屠宰場，其屠宰區域主要包括掛禽間、宰殺瀝血間、浸燙脫羽間、凈膛間、預冷間、包裝間、冷藏間、內臟間，用5 mL無菌槍頭分別在車間的4 個角落和中間各吸取6 mL的地面水或器械水混合均勻后放入無菌離心管中，4 ℃保存。樣品編號分別為掛禽間地表水（WH）、宰殺瀝血間地表水（WS）、浸燙脫羽間地表水（WD）、凈膛間地表水（WE）、預冷間地表水（WPr）、包裝間地表水（WPa）、冷藏間地表水（WPrM）、內臟間地表水（WV）、浸燙脫羽間浸燙水（WScM）、預冷水（WC）。

1.3.2 地面和屠宰器械表面微生物樣品采集

將7.5 cm×7.5 cm的紗布在無菌生理鹽水中蘸濕，均勻擦拭屠宰場各個加工區域中地面以及與雞肉直接接觸的掛鉤、操作臺或傳送帶，最后放置到盛有生理鹽水的無菌離心管中，4 ℃保存。樣品編號為掛禽間掛鉤表面紗布（SHH）、凈膛間掛鉤表面紗布（SHE）、預冷間掛鉤表面紗布（SHPr）、宰殺瀝血間瀝血槽表面紗布（SDS）、預冷間預冷機器表面紗布（SPrM）、包裝間籃筐表面紗布（SPcB）、包裝間桌面紗布（SPcT）、內臟間桌面紗布（SVT）。

1.3.3 樣品處理和細菌基因組DNA提取

將屠宰區域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品按照ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep?提取總細菌DNA。具體操作：將紗布擦拭微生物樣品置于搖床振蕩30 min，然后7 000 r/min離心10 min，去除上清液；采集水樣直接離心，將沉淀重懸于200 μL無菌生理鹽水后，加入ZR BashingBead Lysis Tube，按照試劑盒說明書提取DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 耐藥基因的PCR擴增

本實驗從9 類抗生素耐藥基因中共選取了24 種耐藥基因，包括2 種磺胺類基因（sulI、sulII）、5 種喹諾酮類基因（qnrA、qnrD、qnrS、qepA和oqxB）、4 種四環素類基因（tetC、tetB、tetK和tetA）、3 種氯霉素類基因（cmlA、floR和cfr）、3 種大環內酯類基因（ereA、ermB和mef）、2 種β-內酰胺類基因（blaTEM和blaCTX-M）、2 種青霉素類基因（mecA和mecC）、1 種氨基糖苷類基因（aadA1）、2 種多黏菌素類基因（pmrA和pmrB）。所用引物見表1。PCR程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32 個循環；最后16 ℃保存。擴增反應后進行瓊脂糖凝膠電泳并成像。

表1 PCR反應引物Table 1 PCR primers used in this study

續表1

1.3.5 高通量測序及數據分析

以提取的D N A為模板，擴增環境細菌1 6 S r R N A基因V 3～V 4區，引物為3 3 8 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。通過QIIME軟件對獲取的序列進行質控和過濾，采用ucluster方法根據相似性不小于97%原則將通過質控的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[17]。通過繪制稀釋曲線評價所測序量是否覆蓋全部類群，并采用QIIME軟件默認參數計算各樣品的alpha多樣性指數（ChaoI、ACE、Simpson、Shannon和覆蓋度指數），以及Sliva和RPD數據庫對所有OTU的代表性序列進行物種匹配，最后分別在門和屬的水平上對樣品的細菌組成進行菌群統計繪制柱狀圖。根據各個樣品OTU的種類及其豐度，計算樣品的加權UniFrac距離，再對18 個樣品進行主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）。

1.3.6 大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性評估

大腸桿菌的分離方法參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》。除預冷間的預冷水未檢測出大腸桿菌，其余17 個樣品均檢測出疑似大腸桿菌，采用VITEK2 Compact全自動微生物分析系統儀標準操作流程進行鑒定[18]，顯示均為大腸桿菌。隨后繼續使用VITEK2進行大腸桿菌藥敏實驗，質控菌株為大腸桿菌ATCC25922。從9 類抗生素耐藥基因中選取9 種耐藥基因，包括磺胺類基因（sulI）、喹諾酮類基因（qnrS）、四環素類基因（tetB）、氯霉素類基因（floR）、大環內酯類基因（ermB）、β-內酰胺類基因（blaTEM）、青霉素類基因（mecC）、氨基糖苷類基因（aadA1）、多黏菌素類基因（pmrA），對分離獲得的17 株大腸桿菌進行耐藥基因檢測，所用引物如表1所示。

1.3.7 大腸桿菌的ERIC-PCR分型

腸桿菌基因間重復共有序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）-PCR擴增引物[19]為ERIC-1R（5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’）和ERIC-2（5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’），由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。基因組DNA提取同1.3.3節方法，ERIC-PCR體系（25 μL）：10×buffer 2.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物（各10 μmol/L）均為0.5 μL、TaqDNA聚合酶（1 U/μL）1 μL、模板2.5 μL，其余用ddH2O補齊。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火7 min，72 ℃延伸2 min，共72 個循環；最后72 ℃延伸5 min。取PCR擴增產物與6 倍體積上樣緩沖液混勻后，經質量分數1%的瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）以100 V電壓電泳2 h后，在凝膠成像儀中觀察結果并拍照，并進一步分析。

根據電泳圖譜相同分析范圍內的片段數目及相對位置，以條帶的選擇為基礎，ERIC-PCR產物以“0”、“1”統計，即在相同遷移位置上（相同分子質量片段）有擴增帶的標記為“1”，無擴增帶的標記為“0”。將每個菌株對應的擴增譜帶按“1”和“0”進行統計，經CrossCheck軟件處理后形成二進制數列的矩陣圖后導入NTSYS-pc 2.10軟件，按非加權對數算術平均法進行聚類分析，繪制大腸桿菌遺傳關系圖。凡相似度大于0.8者為同一亞型，在自然進化過程中有著比較近的親緣關系，可能來自于同一克隆，小于0.8者為不同的基因型[20]。

2 結果與分析

2.1 樣品微生物物種豐富度及多樣性

圖1 各樣品稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of each sample

表2 樣品測序概況Table 2 Overview of sequencing results of each sample

經過質控、過濾、拼接等處理，本實驗最終獲得673 888 條有效序列，其中屠宰區域水體樣品（W）有370 425 條有效序列，屠宰器械表面微生物樣品（S）有303 463 條有效序列。所獲得的有效序列根據97%相似性水平進行OTU聚類分析，各樣品最終獲得320～1 242 個OTU，各樣品的覆蓋度指數為0.992～1.000，表明樣本中序列沒有被測出的概率極低，因此本次測序結果能夠代表樣本的真實多樣性組成。各樣品的稀釋曲線均趨于平緩（圖1），說明測序已趨于飽和，測序深度已基本覆蓋樣品中所有的物種。進一步使用ChaoI指數、ACE指數、Shannon指數及Simpson指數對樣本內細菌群落的豐富度和多樣性進行評估（表2）。

2.2 屠宰區域水體、地面和屠宰器械表面細菌菌群結構

圖2 各樣品在門（A）和屬（B）水平上相對豐度前10 名的菌群Fig. 2 Top 10 phyla (A) and genera (B) in each sample

圖3 家禽屠宰場不同區域菌群豐度熱圖（屬水平）Fig. 3 Abundance of bacteria in different section of slaughterhouse(at the genus level)

將18 個屠宰區域水體（W）、地面與屠宰器械表面微生物（S）樣品用于細菌結構測序分析，獲得的OTU分別在門和屬水平上進行物種注釋。由圖2A可知，在門水平上，屠宰區域水體、地面和屠宰器械表面微生物主要分屬于9 個門，其中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度分別為45.18%～87.74%、0.09%～33.46%、3.34%～28.09%，三者共同構成了屠宰場區域水體、地面和屠宰器械表面細菌菌群的主要結構。

由圖2B可知，屬水平上，優勢菌屬為不動桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、皮生球菌屬（D e r m a c o c c u s）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、乳球菌屬（Te t r a g e n o c o c c u s）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和弓形桿菌屬（Arcobacter）。其中不動桿菌屬（Acinetobacter）在屠宰區域水體、地面和屠宰器械表面的相對豐度分別為16.18%～19.88%、7.86%～38.64%、5.66%～41.62%。不動桿菌屬在低溫潮濕環境下能快速繁殖，是禽肉及水產品低溫保存過程中的常見腐敗菌[15]。不動桿菌屬具有一定的致病性，屬于條件致病菌，可引起肺部、傷口、皮膚和泌尿生殖系統感染，甚至會引起菌血癥、腦膜炎等臨床疾病[21]。鏈球菌屬的3 種重要致病菌可引起各種化膿性炎癥、醫源性傷口感染、新生兒敗血癥、細菌性心內膜炎以及風濕熱、腎小球腎炎等超敏反應性疾病[22]。嗜冷桿菌屬是在0～20 ℃之間最適宜生長的細菌，為革蘭氏陰性，主要產生陳腐味[23]。不動桿菌屬在凈膛間掛鉤表面微生物中的相對豐度高達19.88%。這些條件致病菌和腐敗菌廣泛存在于屠宰場區域水體、地面和屠宰器械表面中，可與屠宰加工的雞肉構成交叉污染，致雞肉加速腐敗，還可能引起食源性疾病的發生。各樣品相對豐度前35 名的菌屬見圖3。

2.3 樣品的聚類與PCoA分析

圖4 各樣品菌落結構的PCoA分析Fig. 4 Principal coordination analysis of the dissimilarity among different samples

根據各樣品OTU的種類及其豐度，計算樣品間的加權UniFrac距離，對18 個屠宰區域水體與屠宰器械表面微生物樣品進行了PCoA分析（圖4）。結果表明，同種樣品如屠宰區域水體微生物之間、屠宰場地面和屠宰器械表面微生物之間顯示出明顯聚集，而屠宰區域水體跟屠宰場地面和屠宰器械表面微生物之間相距較遠，與圖3的菌群豐度熱圖結果類似。

2.4 屠宰區域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品的耐藥基因檢測結果

通過對18 個屠宰區域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品中的9大類抗生素24 種耐藥基因的PCR擴增發現，21 種耐藥基因分布在這些樣品中。由此可見屠宰場微生物的耐藥基因檢出率很高，其中sulI、sulII、qnrS、blaTEM和aadA1的檢出率為100%，floR、tetA和ereA的檢出率為88.9%以上（圖5）。

圖5 屠宰場不同區域水體、地面和器械表面微生物耐藥基因PCR檢測結果Fig. 5 PCR results of drug resistance genes of bacteria existing in water samples, on the ground and on surface of slaughtering equipment

畜牧業中濫用抗生素會使有害菌種產生耐藥性及畜產品藥物殘留，通過食物鏈進入到人體中，對人類健康造成巨大的威脅[24-25]。環境中耐藥微生物促進了耐藥致病菌的產生和擴散，抗生素耐藥基因作為一種環境中難以去除的新型污染物，具有可遺傳性和可轉移性[26-27]。家禽屠宰場環境中存在21 種耐藥基因，屠宰場的水體、地面和屠宰器械表面存在的耐藥基因有些許差異，qnrD和qepA基因只分布在屠宰場器械表面。一旦肉雞在屠宰加工生產鏈中受到處理水、屠宰器械的微生物交叉污染，這些耐藥基因極有可能會轉移到雞肉上。耐藥基因隨著人們食用受其污染的雞肉進入人體中，危及人類健康。此外含有耐藥基因的屠宰場廢棄物若不經過處理直接排放，還有可能會污染地下水和增加土壤的微生物耐藥性。本研究在定性水平上展示了耐藥基因在屠宰場的分布狀況，屠宰場對耐藥基因的傳播起到了推進作用，對人類健康和生態環境存在著一定的危害。

2.5 大腸桿菌的耐藥表型和耐藥基因檢測情況

表3 大腸桿菌的藥敏實驗結果Table 3 Drug susceptibility of Escherichia coli

表4 大腸桿菌的多重耐藥性分析結果Table 4 Multi-drug resistance of Escherichia coli

圖6 大腸桿菌多重耐藥性的菌株數統計結果Fig. 6 Multi-drug resistance of Escherichia coli

圖7 大腸桿菌耐藥基因的檢測結果Fig. 7 Drug resistance genes of Escherichia coli

大腸桿菌的多重耐藥性情況如表3、4及圖5～7所示，通過對分離獲得的17 株大腸桿菌的耐藥表型進行分類整理。結果顯示大腸桿菌對17 種抗生素產生了不同的耐藥性，對氨芐西林耐藥率最高（64.71%），其次為復方新諾明、頭孢唑啉、頭孢曲松，耐藥率分別為35.29%、29.41%、29.41%，對哌拉西林、厄他培南、替加環素、硝基呋喃均不敏感。從耐藥菌株數來看，大腸桿菌耐8、9 種和10 種藥物各一株，另外同時耐氨芐西林和復方新諾明2 種藥物的大腸桿菌菌株比例較大，約占17.65%，耐3 種及以上抗生素的大腸桿菌菌株占35.28%。多重耐藥指一種微生物對3 類（如磺胺類、青霉素類、喹諾酮類）或3 類及以上抗生素同時耐藥，而不是對同一類3 種抗生素耐藥。由圖6可知，分離的17 株大腸桿菌中，多重耐藥菌株為7 株，占41.18%，最多耐5 種類型的抗生素，分別為單環β-內酰胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類和磺胺類，同時耐4 類抗生素類型的菌株最多，數目為3 株（17.65%），其中同時耐2 類抗生素的有3 株（17.65%），同時耐3 種類型抗生素的有2 株（11.76%）。

通過對17 株大腸桿菌的9大類9 種耐藥基因的PCR擴增發現（圖7），6 種耐藥基因分布在這些菌株中，由此可見屠宰場大腸桿菌的耐藥基因耐藥率很高。大腸桿菌對blaTEM和pmrA的耐藥基因耐藥率最高，均達到了75%，其次為qnrS、floR、aadA1、sulI，耐藥率分別為70.59%、58.82%、58.82%、23.53%，對ermB、mecC、tetB無檢出。與屠宰場不同區域水體、地面和器械表面微生物的耐藥基因PCR檢測結果相比較，說明屠宰場不同區域水體、地面和器械表面微生物的耐藥基因主要來自于樣品中的大腸桿菌。

2.6 屠宰場水體、地面和器械來源大腸桿菌分離株的ERIC-PCR分型

圖8 屠宰場水體、器械和地面來源大腸桿菌的遺傳關系聚類樹狀圖Fig. 8 Phylogenetic tree of Escherichia coli in slaughterhouse samples

表5 大腸桿菌分型結果Table 5 Typing of Escherichia coli

相似度在50%以上的菌株有相關性親緣關系；相似度在50%以下的菌株被認為流行病學不相關。屠宰場存在水體、地面和與雞肉接觸的器械中大腸桿菌的遺傳相似性在66%～100%。由圖8可知，屠宰場水體、地面和器械來源分離的大腸桿菌在相似系數0.80的水平上，可分為I～V 5 種菌型（表5）。其中ECCNJD145可能是由于采樣的原因或者是實驗操作的原因單獨呈一個親緣關系較遠的基因型，可忽略不計。處于一樓的宰殺瀝血間地表水分離的大腸桿菌，與位于二樓的包裝間地表水分離的大腸桿菌具有相同的ERIC-PCR菌型，表明兩者屬于同一克隆體，大腸桿菌可以沿冷鮮雞屠宰鏈進行克隆傳播。因此在屠宰過程中，處于較低的地表水極有可能在屠宰過程中飛濺從而污染到懸掛著的肉雞。

3 討 論

本實驗通過Illumina高通量測序技術發現家禽屠宰場區域水體、地面和屠宰器械表面微生物的菌群結構以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）為優勢門；在屬的水平上主要為不動桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等一些腐敗菌屬和致病菌屬。從定性水平上反映出屠宰場不同區域的水體、地面和屠宰器械表面存在種類較多的耐藥基因，這些區域來源的大腸桿菌分離株對氨芐西林（64.71%）、復方新諾明（35.29%）耐藥最明顯，且多重耐藥現象嚴重。此外大腸桿菌分離株對9大類9 種耐藥基因的檢出情況與18 個屠宰區域水體、地面與屠宰器械表面微生物樣品耐藥基因的檢出情況吻合度較低，由此說明18 個樣品中還存在其他種類的耐藥菌株。這些屠宰環境的微生物污染狀況會影響周邊環境衛生以及冷鮮雞肉的食品安全問題。

ERIC-PCR技術操作簡單、靈敏度高、可重復性和可靠性好、特異性強，現已成功應用于不同腸桿菌科微生物的基因分型，包括基因作圖、群體分析、菌株多樣性檢測、流行病學以及系統發育與分類學關系的證明[28]。本實驗中大腸桿菌分離株的ERIC-PCR分型研究結果表明，冷鮮雞屠宰場中各環節大腸桿菌呈現較近的親緣關系，大腸桿菌可以沿屠宰生產鏈進行傳播。接下來可深入研究屠宰生產鏈冷鮮雞肉來源的大腸桿菌分離株與屠宰環境來源的大腸桿菌分離株的親緣關系，進一步分析屠宰環境和冷鮮雞肉之間可能存在的大腸桿菌交叉污染關系，以及推斷出屠宰場冷鮮雞肉中微生物污染較嚴重的生產區域。