家禽屠宰場(chǎng)微生物菌群結(jié)構(gòu)及大腸桿菌耐藥性評(píng)估

王佩佩，戴賢君，楊 華，肖英平,*

（1.中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018 ；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021 ；3.浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021 ）

肉雞在屠宰加工生產(chǎn)鏈中易受到微生物的污染，如各屠宰區(qū)域的水、屠宰設(shè)備中微生物的交叉污染，從而增加雞肉的微生物污染水平[1]。屠宰場(chǎng)環(huán)境中存在的腐敗菌會(huì)影響雞肉品質(zhì)和貨架期，一些致病菌威脅著人類(lèi)的健康[2]。肉雞在屠宰過(guò)程中的產(chǎn)生物如血、毛、糞便等廢棄物可能含有耐藥基因，將直接污染屠宰場(chǎng)區(qū)域的水體和地面，未經(jīng)處理排放入環(huán)境中還可能會(huì)污染周邊水體和土壤。因此家禽屠宰場(chǎng)的微生物分布狀況不僅直接影響雞肉的質(zhì)量安全，也關(guān)系到生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肉雞的屠宰加工過(guò)程中特定食源性致病菌的研究較多，如James等[3]發(fā)現(xiàn)肉雞屠宰加工生產(chǎn)鏈中存在單核細(xì)胞增生李斯特菌、彎曲桿菌、沙門(mén)氏菌、糞便梭菌等病原微生物，但對(duì)檢出率較高的大腸桿菌污染溯源以及易造成雞肉微生物交叉污染的家禽屠宰場(chǎng)區(qū)域水體、地面以及屠宰器械表面微生物結(jié)構(gòu)和耐藥基因研究較少。本研究基于16S rRNA V3～V4的Illumina高通量測(cè)序方法，分析家禽屠宰場(chǎng)不同區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物結(jié)構(gòu)特征，并從中分離大腸桿菌，通過(guò)VITEK2進(jìn)行耐藥性評(píng)估，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測(cè)磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)基因等9大類(lèi)耐藥基因，為全面、準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)家禽屠宰場(chǎng)環(huán)境微生物多樣性、耐藥基因傳播擴(kuò)散與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

緩沖蛋白胨水、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose，LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅-美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂、LB肉湯 杭州微生物試劑有限公司；氯化鈉 浙江常青化工有限公司；ex-Taq聚合酶、loading buffer、DL5000 DNA Marker 大連寶生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CF 16RXII高速低溫離心機(jī) 日本Hitachi公司；YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PL202-L電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；生物安全柜山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；-80 ℃超低溫冰箱美國(guó)Thermo公司；VTTEEK微生物自動(dòng)鑒定儀 法國(guó)梅里埃公司；檢測(cè)卡（GNI）和藥敏卡（GN-AST）杭州怡丹生物技術(shù)有限公司；PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 屠宰區(qū)域水體微生物樣品采集

選擇浙江省某屠宰場(chǎng)，其屠宰區(qū)域主要包括掛禽間、宰殺瀝血間、浸燙脫羽間、凈膛間、預(yù)冷間、包裝間、冷藏間、內(nèi)臟間，用5 mL無(wú)菌槍頭分別在車(chē)間的4 個(gè)角落和中間各吸取6 mL的地面水或器械水混合均勻后放入無(wú)菌離心管中，4 ℃保存。樣品編號(hào)分別為掛禽間地表水（WH）、宰殺瀝血間地表水（WS）、浸燙脫羽間地表水（WD）、凈膛間地表水（WE）、預(yù)冷間地表水（WPr）、包裝間地表水（WPa）、冷藏間地表水（WPrM）、內(nèi)臟間地表水（WV）、浸燙脫羽間浸燙水（WScM）、預(yù)冷水（WC）。

1.3.2 地面和屠宰器械表面微生物樣品采集

將7.5 cm×7.5 cm的紗布在無(wú)菌生理鹽水中蘸濕，均勻擦拭屠宰場(chǎng)各個(gè)加工區(qū)域中地面以及與雞肉直接接觸的掛鉤、操作臺(tái)或傳送帶，最后放置到盛有生理鹽水的無(wú)菌離心管中，4 ℃保存。樣品編號(hào)為掛禽間掛鉤表面紗布（SHH）、凈膛間掛鉤表面紗布（SHE）、預(yù)冷間掛鉤表面紗布（SHPr）、宰殺瀝血間瀝血槽表面紗布（SDS）、預(yù)冷間預(yù)冷機(jī)器表面紗布（SPrM）、包裝間籃筐表面紗布（SPcB）、包裝間桌面紗布（SPcT）、內(nèi)臟間桌面紗布（SVT）。

1.3.3 樣品處理和細(xì)菌基因組DNA提取

將屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品按照Z(yǔ)R Fungal/Bacterial DNA MiniPrep?提取總細(xì)菌DNA。具體操作：將紗布擦拭微生物樣品置于搖床振蕩30 min，然后7 000 r/min離心10 min，去除上清液；采集水樣直接離心，將沉淀重懸于200 μL無(wú)菌生理鹽水后，加入ZR BashingBead Lysis Tube，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4 耐藥基因的PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)從9 類(lèi)抗生素耐藥基因中共選取了24 種耐藥基因，包括2 種磺胺類(lèi)基因（sulI、sulII）、5 種喹諾酮類(lèi)基因（qnrA、qnrD、qnrS、qepA和oqxB）、4 種四環(huán)素類(lèi)基因（tetC、tetB、tetK和tetA）、3 種氯霉素類(lèi)基因（cmlA、floR和cfr）、3 種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)基因（ereA、ermB和mef）、2 種β-內(nèi)酰胺類(lèi)基因（blaTEM和blaCTX-M）、2 種青霉素類(lèi)基因（mecA和mecC）、1 種氨基糖苷類(lèi)基因（aadA1）、2 種多黏菌素類(lèi)基因（pmrA和pmrB）。所用引物見(jiàn)表1。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32 個(gè)循環(huán)；最后16 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并成像。

表1 PCR反應(yīng)引物Table 1 PCR primers used in this study

續(xù)表1

1.3.5 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

以提取的D N A為模板，擴(kuò)增環(huán)境細(xì)菌1 6 S r R N A基因V 3～V 4區(qū)，引物為3 3 8 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。測(cè)序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。通過(guò)QIIME軟件對(duì)獲取的序列進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，采用ucluster方法根據(jù)相似性不小于97%原則將通過(guò)質(zhì)控的有效序列聚類(lèi)成為操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）[17]。通過(guò)繪制稀釋曲線(xiàn)評(píng)價(jià)所測(cè)序量是否覆蓋全部類(lèi)群，并采用QIIME軟件默認(rèn)參數(shù)計(jì)算各樣品的alpha多樣性指數(shù)（ChaoI、ACE、Simpson、Shannon和覆蓋度指數(shù)），以及Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有OTU的代表性序列進(jìn)行物種匹配，最后分別在門(mén)和屬的水平上對(duì)樣品的細(xì)菌組成進(jìn)行菌群統(tǒng)計(jì)繪制柱狀圖。根據(jù)各個(gè)樣品OTU的種類(lèi)及其豐度，計(jì)算樣品的加權(quán)UniFrac距離，再對(duì)18 個(gè)樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）。

1.3.6 大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性評(píng)估

大腸桿菌的分離方法參照GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》。除預(yù)冷間的預(yù)冷水未檢測(cè)出大腸桿菌，其余17 個(gè)樣品均檢測(cè)出疑似大腸桿菌，采用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行鑒定[18]，顯示均為大腸桿菌。隨后繼續(xù)使用VITEK2進(jìn)行大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。從9 類(lèi)抗生素耐藥基因中選取9 種耐藥基因，包括磺胺類(lèi)基因（sulI）、喹諾酮類(lèi)基因（qnrS）、四環(huán)素類(lèi)基因（tetB）、氯霉素類(lèi)基因（floR）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)基因（ermB）、β-內(nèi)酰胺類(lèi)基因（blaTEM）、青霉素類(lèi)基因（mecC）、氨基糖苷類(lèi)基因（aadA1）、多黏菌素類(lèi)基因（pmrA），對(duì)分離獲得的17 株大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，所用引物如表1所示。

1.3.7 大腸桿菌的ERIC-PCR分型

腸桿菌基因間重復(fù)共有序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）-PCR擴(kuò)增引物[19]為ERIC-1R（5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’）和ERIC-2（5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供?；蚪MDNA提取同1.3.3節(jié)方法，ERIC-PCR體系（25 μL）：10×buffer 2.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物（各10 μmol/L）均為0.5 μL、TaqDNA聚合酶（1 U/μL）1 μL、模板2.5 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火7 min，72 ℃延伸2 min，共72 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6 倍體積上樣緩沖液混勻后，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）以100 V電壓電泳2 h后，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照，并進(jìn)一步分析。

根據(jù)電泳圖譜相同分析范圍內(nèi)的片段數(shù)目及相對(duì)位置，以條帶的選擇為基礎(chǔ)，ERIC-PCR產(chǎn)物以“0”、“1”統(tǒng)計(jì)，即在相同遷移位置上（相同分子質(zhì)量片段）有擴(kuò)增帶的標(biāo)記為“1”，無(wú)擴(kuò)增帶的標(biāo)記為“0”。將每個(gè)菌株對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增譜帶按“1”和“0”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，經(jīng)CrossCheck軟件處理后形成二進(jìn)制數(shù)列的矩陣圖后導(dǎo)入NTSYS-pc 2.10軟件，按非加權(quán)對(duì)數(shù)算術(shù)平均法進(jìn)行聚類(lèi)分析，繪制大腸桿菌遺傳關(guān)系圖。凡相似度大于0.8者為同一亞型，在自然進(jìn)化過(guò)程中有著比較近的親緣關(guān)系，可能來(lái)自于同一克隆，小于0.8者為不同的基因型[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品微生物物種豐富度及多樣性

圖1 各樣品稀釋曲線(xiàn)Fig. 1 Rarefaction curves of each sample

表2 樣品測(cè)序概況Table 2 Overview of sequencing results of each sample

經(jīng)過(guò)質(zhì)控、過(guò)濾、拼接等處理，本實(shí)驗(yàn)最終獲得673 888 條有效序列，其中屠宰區(qū)域水體樣品（W）有370 425 條有效序列，屠宰器械表面微生物樣品（S）有303 463 條有效序列。所獲得的有效序列根據(jù)97%相似性水平進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析，各樣品最終獲得320～1 242 個(gè)OTU，各樣品的覆蓋度指數(shù)為0.992～1.000，表明樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率極低，因此本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本的真實(shí)多樣性組成。各樣品的稀釋曲線(xiàn)均趨于平緩（圖1），說(shuō)明測(cè)序已趨于飽和，測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有的物種。進(jìn)一步使用ChaoI指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)對(duì)樣本內(nèi)細(xì)菌群落的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估（表2）。

2.2 屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

圖2 各樣品在門(mén)（A）和屬（B）水平上相對(duì)豐度前10 名的菌群Fig. 2 Top 10 phyla (A) and genera (B) in each sample

圖3 家禽屠宰場(chǎng)不同區(qū)域菌群豐度熱圖（屬水平）Fig. 3 Abundance of bacteria in different section of slaughterhouse(at the genus level)

將18 個(gè)屠宰區(qū)域水體（W）、地面與屠宰器械表面微生物（S）樣品用于細(xì)菌結(jié)構(gòu)測(cè)序分析，獲得的OTU分別在門(mén)和屬水平上進(jìn)行物種注釋。由圖2A可知，在門(mén)水平上，屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物主要分屬于9 個(gè)門(mén)，其中變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）的相對(duì)豐度分別為45.18%～87.74%、0.09%～33.46%、3.34%～28.09%，三者共同構(gòu)成了屠宰場(chǎng)區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面細(xì)菌菌群的主要結(jié)構(gòu)。

由圖2B可知，屬水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、皮生球菌屬（D e r m a c o c c u s）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、乳球菌屬（Te t r a g e n o c o c c u s）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和弓形桿菌屬（Arcobacter）。其中不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）在屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面的相對(duì)豐度分別為16.18%～19.88%、7.86%～38.64%、5.66%～41.62%。不動(dòng)桿菌屬在低溫潮濕環(huán)境下能快速繁殖，是禽肉及水產(chǎn)品低溫保存過(guò)程中的常見(jiàn)腐敗菌[15]。不動(dòng)桿菌屬具有一定的致病性，屬于條件致病菌，可引起肺部、傷口、皮膚和泌尿生殖系統(tǒng)感染，甚至?xí)鹁Y、腦膜炎等臨床疾病[21]。鏈球菌屬的3 種重要致病菌可引起各種化膿性炎癥、醫(yī)源性傷口感染、新生兒敗血癥、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎以及風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等超敏反應(yīng)性疾病[22]。嗜冷桿菌屬是在0～20 ℃之間最適宜生長(zhǎng)的細(xì)菌，為革蘭氏陰性，主要產(chǎn)生陳腐味[23]。不動(dòng)桿菌屬在凈膛間掛鉤表面微生物中的相對(duì)豐度高達(dá)19.88%。這些條件致病菌和腐敗菌廣泛存在于屠宰場(chǎng)區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面中，可與屠宰加工的雞肉構(gòu)成交叉污染，致雞肉加速腐敗，還可能引起食源性疾病的發(fā)生。各樣品相對(duì)豐度前35 名的菌屬見(jiàn)圖3。

2.3 樣品的聚類(lèi)與PCoA分析

圖4 各樣品菌落結(jié)構(gòu)的PCoA分析Fig. 4 Principal coordination analysis of the dissimilarity among different samples

根據(jù)各樣品OTU的種類(lèi)及其豐度，計(jì)算樣品間的加權(quán)UniFrac距離，對(duì)18 個(gè)屠宰區(qū)域水體與屠宰器械表面微生物樣品進(jìn)行了PCoA分析（圖4）。結(jié)果表明，同種樣品如屠宰區(qū)域水體微生物之間、屠宰場(chǎng)地面和屠宰器械表面微生物之間顯示出明顯聚集，而屠宰區(qū)域水體跟屠宰場(chǎng)地面和屠宰器械表面微生物之間相距較遠(yuǎn)，與圖3的菌群豐度熱圖結(jié)果類(lèi)似。

2.4 屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)18 個(gè)屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品中的9大類(lèi)抗生素24 種耐藥基因的PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，21 種耐藥基因分布在這些樣品中。由此可見(jiàn)屠宰場(chǎng)微生物的耐藥基因檢出率很高，其中sulI、sulII、qnrS、blaTEM和aadA1的檢出率為100%，floR、tetA和ereA的檢出率為88.9%以上（圖5）。

圖5 屠宰場(chǎng)不同區(qū)域水體、地面和器械表面微生物耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 PCR results of drug resistance genes of bacteria existing in water samples, on the ground and on surface of slaughtering equipment

畜牧業(yè)中濫用抗生素會(huì)使有害菌種產(chǎn)生耐藥性及畜產(chǎn)品藥物殘留，通過(guò)食物鏈進(jìn)入到人體中，對(duì)人類(lèi)健康造成巨大的威脅[24-25]。環(huán)境中耐藥微生物促進(jìn)了耐藥致病菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散，抗生素耐藥基因作為一種環(huán)境中難以去除的新型污染物，具有可遺傳性和可轉(zhuǎn)移性[26-27]。家禽屠宰場(chǎng)環(huán)境中存在21 種耐藥基因，屠宰場(chǎng)的水體、地面和屠宰器械表面存在的耐藥基因有些許差異，qnrD和qepA基因只分布在屠宰場(chǎng)器械表面。一旦肉雞在屠宰加工生產(chǎn)鏈中受到處理水、屠宰器械的微生物交叉污染，這些耐藥基因極有可能會(huì)轉(zhuǎn)移到雞肉上。耐藥基因隨著人們食用受其污染的雞肉進(jìn)入人體中，危及人類(lèi)健康。此外含有耐藥基因的屠宰場(chǎng)廢棄物若不經(jīng)過(guò)處理直接排放，還有可能會(huì)污染地下水和增加土壤的微生物耐藥性。本研究在定性水平上展示了耐藥基因在屠宰場(chǎng)的分布狀況，屠宰場(chǎng)對(duì)耐藥基因的傳播起到了推進(jìn)作用，對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境存在著一定的危害。

2.5 大腸桿菌的耐藥表型和耐藥基因檢測(cè)情況

表3 大腸桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug susceptibility of Escherichia coli

表4 大腸桿菌的多重耐藥性分析結(jié)果Table 4 Multi-drug resistance of Escherichia coli

圖6 大腸桿菌多重耐藥性的菌株數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig. 6 Multi-drug resistance of Escherichia coli

圖7 大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Drug resistance genes of Escherichia coli

大腸桿菌的多重耐藥性情況如表3、4及圖5～7所示，通過(guò)對(duì)分離獲得的17 株大腸桿菌的耐藥表型進(jìn)行分類(lèi)整理。結(jié)果顯示大腸桿菌對(duì)17 種抗生素產(chǎn)生了不同的耐藥性，對(duì)氨芐西林耐藥率最高（64.71%），其次為復(fù)方新諾明、頭孢唑啉、頭孢曲松，耐藥率分別為35.29%、29.41%、29.41%，對(duì)哌拉西林、厄他培南、替加環(huán)素、硝基呋喃均不敏感。從耐藥菌株數(shù)來(lái)看，大腸桿菌耐8、9 種和10 種藥物各一株，另外同時(shí)耐氨芐西林和復(fù)方新諾明2 種藥物的大腸桿菌菌株比例較大，約占17.65%，耐3 種及以上抗生素的大腸桿菌菌株占35.28%。多重耐藥指一種微生物對(duì)3 類(lèi)（如磺胺類(lèi)、青霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)）或3 類(lèi)及以上抗生素同時(shí)耐藥，而不是對(duì)同一類(lèi)3 種抗生素耐藥。由圖6可知，分離的17 株大腸桿菌中，多重耐藥菌株為7 株，占41.18%，最多耐5 種類(lèi)型的抗生素，分別為單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)和磺胺類(lèi)，同時(shí)耐4 類(lèi)抗生素類(lèi)型的菌株最多，數(shù)目為3 株（17.65%），其中同時(shí)耐2 類(lèi)抗生素的有3 株（17.65%），同時(shí)耐3 種類(lèi)型抗生素的有2 株（11.76%）。

通過(guò)對(duì)17 株大腸桿菌的9大類(lèi)9 種耐藥基因的PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)（圖7），6 種耐藥基因分布在這些菌株中，由此可見(jiàn)屠宰場(chǎng)大腸桿菌的耐藥基因耐藥率很高。大腸桿菌對(duì)blaTEM和pmrA的耐藥基因耐藥率最高，均達(dá)到了75%，其次為qnrS、floR、aadA1、sulI，耐藥率分別為70.59%、58.82%、58.82%、23.53%，對(duì)ermB、mecC、tetB無(wú)檢出。與屠宰場(chǎng)不同區(qū)域水體、地面和器械表面微生物的耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果相比較，說(shuō)明屠宰場(chǎng)不同區(qū)域水體、地面和器械表面微生物的耐藥基因主要來(lái)自于樣品中的大腸桿菌。

2.6 屠宰場(chǎng)水體、地面和器械來(lái)源大腸桿菌分離株的ERIC-PCR分型

圖8 屠宰場(chǎng)水體、器械和地面來(lái)源大腸桿菌的遺傳關(guān)系聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig. 8 Phylogenetic tree of Escherichia coli in slaughterhouse samples

表5 大腸桿菌分型結(jié)果Table 5 Typing of Escherichia coli

相似度在50%以上的菌株有相關(guān)性親緣關(guān)系；相似度在50%以下的菌株被認(rèn)為流行病學(xué)不相關(guān)。屠宰場(chǎng)存在水體、地面和與雞肉接觸的器械中大腸桿菌的遺傳相似性在66%～100%。由圖8可知，屠宰場(chǎng)水體、地面和器械來(lái)源分離的大腸桿菌在相似系數(shù)0.80的水平上，可分為I～V 5 種菌型（表5）。其中ECCNJD145可能是由于采樣的原因或者是實(shí)驗(yàn)操作的原因單獨(dú)呈一個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的基因型，可忽略不計(jì)。處于一樓的宰殺瀝血間地表水分離的大腸桿菌，與位于二樓的包裝間地表水分離的大腸桿菌具有相同的ERIC-PCR菌型，表明兩者屬于同一克隆體，大腸桿菌可以沿冷鮮雞屠宰鏈進(jìn)行克隆傳播。因此在屠宰過(guò)程中，處于較低的地表水極有可能在屠宰過(guò)程中飛濺從而污染到懸掛著的肉雞。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Illumina高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)家禽屠宰場(chǎng)區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物的菌群結(jié)構(gòu)以變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）為優(yōu)勢(shì)門(mén)；在屬的水平上主要為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等一些腐敗菌屬和致病菌屬。從定性水平上反映出屠宰場(chǎng)不同區(qū)域的水體、地面和屠宰器械表面存在種類(lèi)較多的耐藥基因，這些區(qū)域來(lái)源的大腸桿菌分離株對(duì)氨芐西林（64.71%）、復(fù)方新諾明（35.29%）耐藥最明顯，且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。此外大腸桿菌分離株對(duì)9大類(lèi)9 種耐藥基因的檢出情況與18 個(gè)屠宰區(qū)域水體、地面與屠宰器械表面微生物樣品耐藥基因的檢出情況吻合度較低，由此說(shuō)明18 個(gè)樣品中還存在其他種類(lèi)的耐藥菌株。這些屠宰環(huán)境的微生物污染狀況會(huì)影響周邊環(huán)境衛(wèi)生以及冷鮮雞肉的食品安全問(wèn)題。

ERIC-PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、可重復(fù)性和可靠性好、特異性強(qiáng)，現(xiàn)已成功應(yīng)用于不同腸桿菌科微生物的基因分型，包括基因作圖、群體分析、菌株多樣性檢測(cè)、流行病學(xué)以及系統(tǒng)發(fā)育與分類(lèi)學(xué)關(guān)系的證明[28]。本實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌分離株的ERIC-PCR分型研究結(jié)果表明，冷鮮雞屠宰場(chǎng)中各環(huán)節(jié)大腸桿菌呈現(xiàn)較近的親緣關(guān)系，大腸桿菌可以沿屠宰生產(chǎn)鏈進(jìn)行傳播。接下來(lái)可深入研究屠宰生產(chǎn)鏈冷鮮雞肉來(lái)源的大腸桿菌分離株與屠宰環(huán)境來(lái)源的大腸桿菌分離株的親緣關(guān)系，進(jìn)一步分析屠宰環(huán)境和冷鮮雞肉之間可能存在的大腸桿菌交叉污染關(guān)系，以及推斷出屠宰場(chǎng)冷鮮雞肉中微生物污染較嚴(yán)重的生產(chǎn)區(qū)域。