三七絨根栽培白參菌及皂苷轉(zhuǎn)化初步研究

張玉潔，王禎元，韋繼雯，陳中堅(jiān)，閆倩玲

（1.文山學(xué)院 三七研究院，云南 文山 663099；2.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；3.文山州食品藥品檢驗(yàn)研究院，云南 文山 663099）

白參菌（Schizophyllum commune Fr.）別名樹花、裂褶菌、白花、八擔(dān)柴、雞毛菌子、雞冠菌等，為傘菌目（Agaricales）裂褶菌科（Schizophyllaceae）裂褶菌屬（Schizophyllum）[1]。白參菌子實(shí)體秀雅、味道馨香爽口，其作為一種食藥兼用菌類，包含5種常量元素和26種微量元素，具有富硒作用[2]。研究顯示其細(xì)胞壁多糖具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎、抗癌作用[3]。白參菌作為一種木腐菌，較易在腐爛的木頭或者草本植株上生長，要求較為濕潤和偏弱酸性的生長環(huán)境[4]。葡萄糖是白參菌菌絲生長的最適碳源，最適的氮源是蛋白胨，最適碳氮比值為40∶1，在碳氮比不同的培養(yǎng)料中栽培，白參菌菌絲生長速度不同，或生長遲緩或生長受到抑制[4]。野生白參菌的采摘會(huì)受季節(jié)限制，而且產(chǎn)量較少。至今為止，白參菌人工栽培生物學(xué)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量仍然較低[5]，目前仍屬于稀有菌類和食藥兼用菌類。

三七是云南大宗產(chǎn)業(yè)、文山是三七之鄉(xiāng)。三七采挖抖落的土壤中含有大量的絨根，其中也含有一定量的三七皂苷。研究利用三七絨根栽培食用菌既可以清理土壤殘留，又可以有效利用中藥材的邊角廢料，生產(chǎn)功能食品。

1 材料和方法

1.1 原材料和試劑

三七絨根篩自三七采挖抖落的土壤并曬干保存。白參菌菌種由實(shí)驗(yàn)室分離得到，保存于文山學(xué)院三七研究院。麩皮、小麥、石膏粉、木屑、馬鈴薯、甘蔗渣等從文山市場購買；耐高溫栽培袋、蓋、塞等由專業(yè)訂購。三七總皂苷、薄層層析板和分析試劑購自深圳市商祺檢測器材有限公司。

1.2 母種擴(kuò)繁和栽培種制作

利用PDA培養(yǎng)基活化并擴(kuò)繁母種。利用小麥粒培養(yǎng)基擴(kuò)繁栽培種[6]。

1.3 配料、裝袋、滅菌、栽培、養(yǎng)菌、出菇管理和子實(shí)體采集

參考前期研究[7]，采用以甘蔗渣為主料的配方為對(duì)照栽培白參菌，以不同比例的三七絨根替代其中的甘蔗渣為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組原料及配方如表1。

表1 培養(yǎng)料及配方/%

各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組按照培養(yǎng)料配方和所需原料的總量來備料。三七絨根和甘蔗渣剪碎稱重后分別浸泡。將含水量調(diào)至60%后備用。

利用17×46×0.15 cm聚丙烯耐高溫菌袋。每個(gè)菌包裝料500 g（濕料），包括4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。每組20個(gè)菌包，共100個(gè)。

滅菌：121 ℃，2.5 h。

接種：接種需要在無菌環(huán)境下進(jìn)行。用種量為5%。

菌絲培養(yǎng)：白參菌屬于中低溫型菌類，菌絲生長要求15～26 ℃間，出菇溫度控制在16～23 ℃。適宜溫度下在接種后20 d左右開始出菇。其最佳種植季節(jié)是春栽3～5月，秋栽9～11月，在大棚種植環(huán)境下可以完成每年4～6茬，同時(shí)還可以完成工廠化控溫周年化的生產(chǎn)。

出菇管理和子實(shí)體采收參考[7]：開袋出菇，噴水保濕并保持通風(fēng)良好。待子實(shí)體葉片長到將要平展時(shí)進(jìn)行采收。每組采收2潮。

產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)分析：記錄并統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組白參菌菌絲生長速度（菌絲長滿菌袋所需時(shí)間）和子實(shí)體的平均產(chǎn)量。采用SPSS17.0軟件和Microsoft Excel 2003對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 子實(shí)體中皂苷類成分的跟蹤檢測

真菌細(xì)胞可以選擇吸收環(huán)境中的小分子物質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞的小分子有機(jī)物有些可以被細(xì)胞里的酶進(jìn)行基團(tuán)轉(zhuǎn)化或修飾。因此，利用薄層層析方法檢測三七皂苷被白參菌菌絲吸收及轉(zhuǎn)化情況。

所檢樣品分為兩組。一組是子實(shí)體組，包括未添加三七絨根所培養(yǎng)采收的白參菌子實(shí)體和分別添加10%，15%，20%三七毛根所培養(yǎng)的白參菌子實(shí)體；另一組為菌糠組，分別為添加了10%，15%，20%三七絨根培養(yǎng)白參菌采收子實(shí)體后所剩余的菌糠。

樣品處理：將各樣品進(jìn)行干燥、研磨，粉碎備用。

皂苷提取：每樣品稱量5 g，加水50 mL，超聲震蕩30 min，離心去殘?jiān)ＨV液揮干至10 mL左右，用D-101大孔樹脂凈化柱過濾（小柱用10 mL水沖洗），棄去水液。用70%甲醇（42.7蒸餾水+57.2甲醇）25 mL洗脫皂苷，收集甲醇溶液，水浴揮至近干，殘?jiān)约状既芙舛ㄈ葜? mL，進(jìn)行層析檢測。

對(duì)照：三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（含量以三七皂苷R16.9%,人參皂苷Rg128.0%,人參皂苷Rb129.7%,人參皂苷Rd 7.3%）,加甲醇制成1 mL各含5 mg的混合溶液。另取三七粉0.5 g，與供試樣品一起處理，抽提皂苷成分作為陽性對(duì)照。

利用高效硅膠60預(yù)制板（Merck）為層析板，以氯仿∶甲醇∶水（65∶35∶10）為展開劑，供試液與對(duì)照液分別點(diǎn)樣0.2 μL。展開箱預(yù)平衡15 min，上行展開，展距7 cm。噴以硫酸乙醇液（1∶10）染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七絨根栽培白參菌的生物學(xué)表現(xiàn)

利用甘蔗渣和少量的三七殘根為主料栽培白參菌，菌絲初期生長很快，中后期由于內(nèi)部供氧不足而生長緩慢，限制了菌絲生長速度，刺孔增氧后菌絲逐步延伸到袋底。統(tǒng)計(jì)顯示，少量的三七殘根不會(huì)抑制白參菌菌絲生長，反而會(huì)有一定的促進(jìn)作用并可增加子實(shí)體產(chǎn)量。15%以上的三七絨根開始顯著抑制菌絲生長，并可降低子實(shí)體產(chǎn)量。當(dāng)三七絨根用量超過20%時(shí)，菌包內(nèi)菌絲生長稀疏、只生長出很少的子實(shí)體，表明白參菌細(xì)胞對(duì)三七殘根的耐受能力具有一定的限度。表2和表3分別顯示各組菌包菌絲長滿菌袋所需的平均時(shí)間，菌絲平均日生長速度、袋均產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率。

圖1 普通培養(yǎng)基栽培的白參菌

圖2 三七絨根培養(yǎng)基栽培的白參

表2 不同含量的三七殘根對(duì)裂褶菌菌絲生長速度的影響

表3 不同配方培養(yǎng)料對(duì)裂褶菌產(chǎn)量和生物學(xué)效率的影響

2.2 皂苷成分的跟蹤檢測

將從各級(jí)樣品中抽提的皂苷類生物堿，利用薄層色譜法進(jìn)行展層和染色得到如下皂苷色譜圖。

左側(cè)層析板由左到右分別為三七總皂苷、菌糠（含絨根10%）、菌糠（含絨根15%）、菌糠（含絨根20%）；右側(cè)層析板從左到右為白參菌子實(shí)體（10%殘根料培養(yǎng)所得）、三七粉、 三七總皂苷、子實(shí)體（15%殘根培養(yǎng)所得）、子實(shí)體（20%殘根培養(yǎng)所得）。三七總皂苷（三七皂苷R16.9%,人參皂苷Rg128.0%,人參皂苷Rb129.7%,人參皂苷Rd 7.3%）

總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品自下而上分別為人參皂苷Rb1，Re，三七皂苷R1，人參皂苷Rd。

其中，利用三七粉抽提所得三七皂苷和皂苷標(biāo)準(zhǔn)品主條帶基本一致。左側(cè)層析板顯示，各實(shí)驗(yàn)組菌糠中皂苷成分與標(biāo)準(zhǔn)品相比都有所變化，表現(xiàn)為下面兩個(gè)條帶的減少和展層上面條帶的增加。此效果或許因?yàn)榕囵B(yǎng)料中三七皂苷在高溫高壓過程使Rb1，Re分子中的糖配體被降解，或許因?yàn)榫z生長過程中白參菌細(xì)胞對(duì)皂苷分子進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化。

圖3 菌糠與子實(shí)體中皂苷含量層析色譜

對(duì)子實(shí)體中皂苷類物質(zhì)成分檢測的結(jié)果顯示，有些小分子皂苷被白參菌菌絲成功吸收。說明三七皂苷成分可以被菌絲吸收并被轉(zhuǎn)移到白參菌子實(shí)體中。

3 結(jié)論與討論

利用三七殘根培養(yǎng)白參菌，子實(shí)體中會(huì)出現(xiàn)與三七粉和三七皂苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品中某些對(duì)應(yīng)的三七皂苷植物堿的染色點(diǎn)，說明白參菌菌絲體吸收了培養(yǎng)料中的某些小分子皂苷成分或皂苷的降解產(chǎn)物。

培養(yǎng)料中添加少量的三七根對(duì)白參菌菌絲生長具有促進(jìn)作用，并可提子實(shí)體高產(chǎn)量。三七根的用量超過15%會(huì)抑制白參菌菌絲體和子實(shí)體的生長，說明白參菌對(duì)三七絨根的利用有機(jī)一定限度。