草果胚培養技術研究

胡 彥，張 鐵，張志信，楊緒旺，胡展育

（1.文山學院 環境與資源學院，云南 文山 663099；2.文山學院 化學與工程學院，云南 文山 663099）

草果（Amomum tsao-ko）是姜科豆蔻屬多年生植物，生長在熱帶、亞熱帶蔭蔽潮濕的闊葉林中，主要分布于中國云南、廣西、貴州等地。草果果實是傳統的中藥材和調味品。草果具有特殊濃郁的辛辣香味，是一種很好的調味香料；此外，具有燥濕溫中、截瘧祛痰、瘟疫發熱、消食化亂之功效；可以治療寒濕內阻，脘腹脹痛，痞滿嘔吐，瘧疾寒熱，瘟疫發熱等病癥[1]。草果中的揮發油，含有幾十種化學成分，其中的桉油精、香葉醇、檸檬醛等化學成分，具有抗真菌、細菌[2-3]，抗癌[4]、清除DPPH自由基的作用[5]，廣泛應用于醫藥和香料工業[6]。云南是我國草果的主要產地，文山州馬關縣有“中國草果之鄉”的稱號，但在栽培上缺乏優良品種，草果產量不高。草果繁殖的方法，一是采用播種繁殖[7]，二是分株繁殖[8]，蕭洪東等[9]以草果側芽為外植體進行組織培養的方法已經有報道，但筆者經過試驗后發現其污染率極高，而有關草果胚培養未見報道。本研究以草果的胚為外植體進行組織培養，培養草果無菌苗，取草果無菌苗莖段進行不定芽誘導，然后進行生根培養，以期取得最佳培養基配方，建立草果無性快繁體系，為云南省各地區規模化生產草果優良的種苗提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取充分成熟的草果種子胚作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基制備

按配方配制實驗用培養基，分裝入培養瓶后經高壓濕熱（壓力0.12 MPa、溫度121 ℃）滅菌25 min，備用。

1.2.2 胚培養

選取充分成熟的草果果實，先用洗潔精將草果清洗干凈，然后放入超凈工作臺內，在無菌燒杯中用75%酒精浸泡10 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡15 min后，以無菌水洗3次，然后取出草果種子，放入滅菌后的燒杯中，按上述草果果實的消毒方法，再對草果種子進行消毒。在無菌條件下，用解剖刀剝取草果胚，接種于下列培養基中：（1）MS+1.0 mg·L-12，4-D；（2）MS+1.0 mg·L-1NAA；（3）MS+1.0 mg·L-1IAA。每種培養基配制20瓶，每瓶培養基中接種2～3粒草果胚。先在25 ℃下進行暗培養20 d，當胚萌發產生愈傷組織膨大后，轉入光下培養，光照強度1 600～2 100 lx，溫度（25±2）℃，濕度控制在65%～75%，光照12 h·d-1。每10 d觀察1次草果胚生長情況，光照培養總時間約30 d，胚直接發育形成無菌苗。計算成苗率，成苗率（%）＝草果的苗數／接種的胚數×100。

1.2.3 正交實驗設計研究草果不定芽的增殖培養

在查閱前人試驗的基礎上[9]，采用L9（34）正交實驗設計，篩選草果不定芽增殖培養適宜的培養基，試驗因素及水平見表1。取以胚為外植體培養的草果無菌苗，在無菌條件下切成帶1～2個節間的莖段，插入9種不同的培養基中進行不定芽誘導，每瓶插入1～2個莖段。培養條件為：溫度為25 ℃，光照時間15 h，光照強度為2 000 lx；濕度為75%。

表1 正交實驗的因素及水平

誘導培養30 d后，觀察記錄已萌發的外植體（草果莖段）的數量，計算萌發率。萌發率=已萌發的外植體數÷接種的外植體數。增殖培養前及接種培養30 d后，分別記錄每一芽叢的芽數，計算增殖芽數。

增殖芽數=培養后芽數-培養前的芽數

1.2.4 驗證試驗

通過正交實驗確定最佳不定芽增值培養基配比，再將最佳試驗處理進行3次重復試驗，檢驗該培養基在誘導草果不定芽培養時的可靠性。

1.2.5 生根培養

在超凈工作臺上切取健壯的經過增殖培養的草果不定芽，分別接種于以下生根培養基中：（1）MS+0.2 mg·L-1IBA；（2）MS+0.2 mg·L-1NAA；（3）MS+0.1 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA。觀察不同培養基對草果生根率和根生長情況的影響。以上每種生根培養基接種10瓶，每瓶接種1～2 株不定芽。

培養條件為光照強度1 500～2 000 lx，溫度（25±2）℃，濕度控制在60%～75%，光照12 h·d-1。培養時間約30 d，每10 d觀察1次草果不定芽生根生長情況。計算生根率，生根率（%）＝生根的不定芽數／接種的不定芽數×100。

1.2.6 煉苗移栽

草果不定芽生根培養30 d后，轉移到蔭棚中煉苗，煉苗時間12 d，煉苗結束后，取出小苗，用清水洗凈附著在根系上的培養基，然后栽植在營養杯中（營養土由消毒過的腐葉土和菜園土（3∶1）混合配成），置于蔭棚下，按常規育苗技術進行水肥管理。

1.3 數據分析

采用Excel 2007軟件統計試驗數據，用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 胚培養

由草果種子中取出的胚，分別接種于含有2，4-D、NAA、IAA各1.0 mg·L-1的 MS培養基上，先進行暗培養，然后轉入光照條件下培養，50 d后，統計成苗率，其結果如下：1.0 mg 2，4-D對誘導胚成苗效果最好，為76.5%、1.0 mg NAA誘導胚成苗率65.3%、1.0 mg IAA誘導成苗率62.6%。（見圖1：1，圖1：2）

2.2 正交實驗不同激素及濃度對草果不定芽增殖培養的影響

由表2可知，處理5，即在添加2.0 mg·L-16-BA，1.5 mg·L-1NAA 和1.0 mg·L-12，4-D的MS培養基上，草果莖段不定芽萌發率最高，達到了89%；極差分析得出，影響草果不定芽分化的主次因素為A＞C＞B，即 6-BA＞2，4-D＞NAA；草果不定芽誘導的最優方案為A2B2C3，即MS+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D（見圖1：3）。

表2 正交實驗結果

由表3可知，6-BA對草果莖段不定芽萌發率的誘導在0.01水平下顯著；NAA，2，4-D對草果莖段不定芽萌發率的誘導在0.05水平下均不顯著，這與極差分析方法結果一致。

表3 正交實驗方差分析

2.3 驗證試驗

根據正交實驗結果，準確地在MS培養基中添加2.0 mg·L-16-BA ，1.5 mg·L-1NAA 和 1.0 mg·L-12，4-D進行重復實驗。其草果莖段不定芽萌發率為90%，芽粗壯，說明該實驗結果較穩定，不定芽萌發率高，該培養基為最佳培養基。本實驗增殖培養階段的平均增殖率為2.5，尚需進一步研究以提高增殖率。

2.4 生根培養

采用三種不同的培養基配方誘導草果不定芽生根，處理（3），即在添加 0.1 mg·L-1IAA，0.1 mg·L-1NAA 和 1.0 mg·L-1IBA的MS培養基上，不定芽生根率最高，達到97%，并且芽苗生根較好，根較多且粗，其次為處理（2），即在添加0.2 mg·L-1NAA的MS培養基上，生根率88%，生根率最低的是處理（1），即在添加0.2 mg·L-1IBA的MS培養基上，生根率為82%。（見圖1：4）

2.5 煉苗移栽及成活率

煉苗移栽后，試管苗恢復生長較快，植株較均勻整齊，試管苗成活率100%。

圖1 草果胚培養無性快繁技術生長過程圖片

3 討論與結論

筆者曾經采用草果的側芽（筍芽）為外植體，開展草果優良品種組培快繁研究，但由于草果帶菌多，采用多種方法均未解決污染問題（真菌及細菌污染），導致實驗失敗。本研究以草果種子的胚為外植體，分別對其進行胚培養、不定芽增殖培養和生根培養實驗，并篩選出了最佳培養基配方。（1）胚培養培養基：MS+1.0 mg·L-12，4-D；（2）不定芽增殖培養基：MS+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D；（3）生根培養基：MS+0.1 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA。本實驗增殖培養階段的平均增殖率約為2.5，需進一步研究以提高增殖率。

對于組織培養，外植體的消毒是比較困難的環節，所以外植體的選擇非常關鍵。本實驗采用草果種子胚作為外植體，在消毒過程中首先對草果果實消毒，然后對種子的種皮消毒，并未傷害到種子里面的胚，避免了消毒劑對外植體的毒害，接種成活率高。

草果為多年生常綠叢生草本經濟植物，其果實既可作為中藥材，也可作為調味香料用于菜肴烹飪，一般草果種植3～4年后即可開花結果，可連續結果20年以上。種植草果是山區農民增收的重要經濟來源，是脫貧致富的一條重要途徑[10]。草果種子胚培養無性快繁技術體系的建立，可為云南省各地區規模化生產草果優良品種種苗提供技術支持。