山東省6例豬圓環病毒3型檢測及Cap結構遺傳進化分析

劉曉東，郝堯光，馬振乾，李 坤，董雅琴，高 豐

(1.吉林大學動物醫學學院，吉林 長春 130062；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266000；3.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266000）

豬圓環病毒屬于圓環病毒科是一種環形單鏈DNA病毒，PCV無囊膜，呈球狀的二十面體對稱結構，由衣殼蛋白（Cap）和基因組組成[1-2]。2016年前，國內僅發現PCV1和PCV2兩個基因型。PCV1無致病性，PCV2是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、仔豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征以及繁殖障礙等疾病的病因。臨床上，PCV2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬肺炎支原體等病原混合感染，造成養豬業巨大經濟損失[3-10]。2016年美國首次在病豬體內鑒定出PCV3[11]。隨后在2017年我國也不斷報道PCV3的存在[12-13]。但在山東省內PCV3的流行情況還不清楚，因此研究PCV3的遺傳進化，為PCV3分子遺傳進化和有效防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

2018 年采集山東省6 份具有臨床表現繁殖障礙和呼吸道疾病的豬的PCV3陽性病料，-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑

2×Taq MasterMix，r Taq DNA聚合酶、DL2000DNAMarker和MiniBEST Universal Genomic DNA Ex-traction Kit Ver.5.0等均購自TaKaRa 公司與寶生物工程（大連）有限公司，DNA回收試劑盒購自北京鼎國昌盛生物公司。其余試劑均為國產分析純。

1.3 病毒核酸的提取

所取檢測樣品為發病豬的肺臟、脾臟及淋巴結剪碎后充分勻漿，于－20 ℃冰箱反復凍融3次。取700 μL勻漿液上清[14]，使用酚氯仿法抽提 DNA，每個樣品用50 μL雙蒸水溶解，保存于－20 ℃冰箱。

1.4 PCR 擴增

以提取的病料樣品基因組DNA為模板，擴增PCV3的目的基因。上游引物序列 F：5'-TTACTTAGAGAACGGACTTGT AACG-3'，下游引物R：5'-AAATG AGACACAGAGCTATATTCAG-3'。反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPMixture (2.5 mmol/L) 2 μL，各上、下游引物各0.8 μL，模板 DNA 2 μL，r Taq (5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 補足 25 μL。PCR 反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、50 ℃～58.5 ℃ 45 s、72 ℃ 1～2 min，35 個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產物大小為651 bp。

1.5 基因測序分析

序列分析 以DNAStar中的Megalign比對山東分離的PCV3毒株與GenBank已公布PCV1、PCV2和PCV3參考毒株的Cap基因序列同源性，并預測Cap蛋白信號肽、糖基化位點等遺傳進化。

2 結果

2.1 樣品陽性率及混感情況

對2018年的6份PCV3陽性樣品進行檢測發現：在繁殖障礙、呼吸道癥狀及消瘦的臨床癥狀中均能檢測到PCV3的存在（如表1）。

2.2 凝膠電泳結果

對病料組織進行PCR檢測，結果顯示：6病料均為陽性，擴增產物大小為 651 bp，與引物設計一致。

表1 PCV3的檢測結果

圖1 病料RT-PCR產物電泳圖

2.3 核苷酸及氨基酸同源性

通過DNAStar-Megalign程序對序列進行比對，結果顯示，山東省6株PCV3 Cap基因之間的核苷酸序列同源性為98.3%～99.8%，編碼的氨基酸序列同源性為98.6%～99.7%；與PCV1核苷酸序列同源性為35.1%～35.4%，編碼的氨基酸序列同源性為33.9%～35.7%；與PCV2核苷酸序列同源性為：34.4%～38.6%，編碼的氨基酸序列同源性為33.9%～38.1%。與美國參考株的核苷酸序列同源性為97.3%～99.8%，編碼的氨基酸序列同源性為97.7%～99.7%（如圖2、圖3）。

2.4 進化樹

對6株分離毒株與參考毒株通過進化樹對比發現2株屬于PCV3a，4株屬于PCV3b，說明山東PCV3毒株既有PCV3a也有PCV3b(為標準毒株，沒有標為檢測毒株)（如圖 4）。

2.5 遺傳進化情況

所分離的6株PCV3與美國毒株僅存在散在變異位點，但與PCV1及PCV2抗原表位差異明顯，說明PCV3的保守性較好，該病毒在進入中國后并沒有發生進一步的重組進化，但與PCV1及PCV2差異較大（如圖5與圖6）。

3 討論

通過對PCV3陽性病料進行分析發現，此次PCV3陽性病料以繁殖障礙、消瘦及呼吸道癥狀為主與其他病癥相似，這給臨床診斷帶來了一定困難。

通過同源性對比發現山東分離的PCV3與PCV1及PCV2同源性較低只有30%左右，山東PCV3通常既有PCV3a也有PCV3b，與美國毒株同源性很高達到97%以上；對其Cap蛋白基因分析發現只存在零散堿基突變，可以推測：山東省內的PCV3并沒有太大變異情況發生。這與 Palinski R結論一致[15]。

對山東分離毒株的PCV3 Cap蛋白質與PCV2 Cap蛋白質的氨基酸殘基比較分析，在Cap蛋白N端均含有大量精氨酸殘基和稀有密碼子,但Cap蛋白的B細胞抗原表位差異明顯，無相似性，Cap蛋白結構及抗原性存在明顯差異，因此推測PCV2和PCV3間交叉保護水平較低,說明現有的豬圓環病毒疫苗基本不能給予PCV3有效保護。此結論與Shang得出PCV3 Cap蛋白氨基酸比PCV2 Cap蛋白氨基酸序列缺失掉了8個氨基酸，而這8個氨基酸位于病毒衣殼的外表面位置，這個位置更適合外源抗原表位的插入，PCV3毒株和PCV2毒株的抗原交叉保護性極低的結論推斷一致[16]。

圖2 核苷酸同源性

圖3 氨基酸同源性

圖4 進化樹分析

圖 5 PCV3 核苷酸分析

圖 6 PCV3 氨基酸分析

4 結論

我國對于PCV3的研究尚處于起步階段，需對PCV3進行大量的研究及檢測，通過對山東省發病場的PCV3調查，證明PCV3在山東省也存在，且癥狀復雜，同時PCV3和PCV2間交叉保護水平較低,現有的豬圓環病毒疫苗基本不能給予PCV3有效保護，在沒有有效疫苗進行防控期間我們必須要堅持“早發現、早報告、早隔離、早診斷、早撲滅”原則做好安全措施，保證豬群健康，同時跟蹤監控好PCV3的流行及變異情況，為科學防控提供參考數據。