兩種稀釋劑不同稀釋倍數對豬精液保存效果的研究

張 丹，付永利，唐佩娟，劉 鑫，殷 茵，于海霞，李澤清，張 穎，李 奎，崔茂盛*

（1.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧總站，天津 300402；3.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381；4.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100094）

自從20世紀80年代豬人工授精廣泛應用以來，現階段實際輸精操作中90%以上采用恒溫保存精液，有研究表明，精液稀釋倍數對精液的長期保存具有明顯的影響，稀釋比例較小，精子密度較大，隨著精子不斷代謝導致營養物質無法滿足精子的長期存活；除此以外，高密度精子代謝產生的不利影響較大。而精液稀釋比例過大，精子易受稀釋打擊，導致有效精子數降低，進一步影響人工授精質量[1-2]。因此生產中普遍采用4～6倍稀釋[3]。本試驗是在前期工作基礎上，進一步探討本課題組自行研發的豬鮮精17 ℃常溫保存稀釋劑在高倍稀釋下對精子的保護效果。期望在保證精液保存質量的前提下，提高豬精液稀釋比例，增加優秀種公豬精液利用率。

1 試驗準備

1.1 試驗時間

2018年4月-2018年10月。

1.2 試驗地點

天津市天泰星火豬人工授精服務中心。

1.3 試驗材料與方法

1.3.1 精液采集

試驗選取5頭進行正常生產的2～4歲大白種公豬，采用手握法采精，收集中段富含精子部分，精子活率達到0.8以上、精子密度在1.5億/mL以上的原精用于后續試驗。

1.3.2 試劑與儀器

主要試劑：果糖、海藻酸鈉（上海源葉生物科技有限公司），葡萄糖（天津市光復精細化工研究所），青霉素、鏈霉素（山東魯抗舍里樂藥品有限公司），甘氨酸、EDTA等（sigma中國有限公司）。

主要儀器設備：CASA計算機自動輔助分析系統（福州鴻視野軟件技術有限公司），相差顯微鏡（蔡司ZEISS），恒溫冰箱（青島畜牧有限公司），電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司），精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

1.3.3 稀釋液配制

BTS：使用分析天平稱取 EDTA 1.25 g，碳酸鈉1.25 g，檸檬酸鈉14.8 g，氯化鉀0.75 g，青霉素0.6 g，葡萄糖37 g，硫酸鏈霉素1 g，使用磁力攪拌器充分溶解于900 mL的滅菌蒸餾水中，調pH至7.2，定容至1 L。

配方組：在BTS稀釋液基礎中每升添加海藻酸鈉1 g，果糖0.2 g和甘氨酸0.4 g。

2 試驗設計

本試驗在17 ℃恒溫條件下，以BTS稀釋劑為對照、本課題研發的配方組為試驗組，對原精進行1，3，5，10和15倍稀釋，以精液有效保存時間、精子活力、質膜和頂體完整性為保存效果的評價指標，試驗重復3次。

2.1 精子質量檢測方法

精子活力為：直線前進運動精子數占精子總數的比值，此數值通過精子自動分析儀自動檢測；質膜完整性采用低滲腫脹試驗檢測；頂體完整率采用精子快速染液檢測。

2.2 數據處理

試驗所得的各組數據用Excel進行前期處理，再用SPSS17.0軟件進行One-way ANOVA方差分析，并進行多重比較，試驗結果用“平均數±標準差”表示，P值大于0.05表示差異不顯著，反之則差異顯著。

3 試驗結果

3.1 不同稀釋比例下豬精液有效保存時間研究

本研究中精子活力是指：直線向前運動精子數占總精子數的百分率。有效保存時間是指精液稀釋后精子活力維持在60%以上的時間。不同稀釋比例豬精液有效保存時間如表1所示。

如表1所示，配方組在各稀釋比例下精子有效保存時間均顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，配方組在5倍和10倍稀釋時精液有效保存時間分別為8.77 d和8.43 d，而15倍稀釋時配方組中精液有效保存時間明顯下降，僅為4.56 d。對照組中，精液最長有效保存時間為3倍稀釋下的3.1 d。

3.2 不同稀釋比例對精子質膜完整性影響的研究

因為對照組精液有效保存時間最長為3 d，因此本試驗檢測第3天各稀釋比例的豬精子質膜完整性，研究結果如表2所示。

保存第3天時，隨著原精稀釋比例的升高，對照組與配方組精子質膜完整率均呈現先升高后下降趨勢，但配方組質膜完整性均顯著高于對照組（P＜0.05）。5倍稀釋時，對照組質膜完整率為70%，而配方組質膜完整率為79%；10倍稀釋時，配方組精子質膜完整率為82%，對照組則為69%；但15倍稀釋時，對照組和試驗組質膜完整性均有所下降。

3.3 不同稀釋比例對精子頂體完整性影響的研究

同樣，本試驗檢測第3天各稀釋比例的豬精子頂體完整性，研究結果如表3所示。

保存第3天時，隨著原精稀釋比例的升高，BTS組與配方組精子頂體完整率均呈現先升高后下降趨勢，但配方組質膜完整性均顯著高于對照組（P＜0.05）。5倍稀釋時，對照組質膜完整率為76%，而配方組質膜完整率為85%；10倍稀釋時，配方組精子質膜完整率為87%，對照組則為73%；但15倍稀釋時，對照組和試驗組頂體完整性均有所下降。

4 討論

本科研團隊已研發出豬精液高效稀釋劑，在17 ℃常溫保存可穩定5～7 d，若原精質量較好可有效保存10 d以上[4]；在此基礎上本課題還研發了豬精液4 ℃低溫保存高效稀釋液，進一步延長了豬精液體外保存時間[5]。本試驗旨在探討本課題研發的豬精液17 ℃常溫保存稀釋液在對豬精原精進行高倍稀釋條件下，對精子的保存效果。精液稀釋倍數一般要結合精液自身的品質進行確定，生產中常利用精子密度、活率判斷稀釋倍數[6-8]。張金玲等人利用不同稀釋比例探究抗生素種類對精液保存質量的影響，結果表明，常溫保存的最佳稀釋比例為1∶1～1∶2[9]，但沈培敏等人對豬精液稀釋倍數研究發現，稀釋倍數為4倍和6倍時精子的活率較高，并且具有較高的受胎率[10]。不同研究結果的出現可能和稀釋液的成分組成相關[11]，本試驗采用果糖+甘氨酸+海藻酸鈉的組合形式，結果表明：隨著原精稀釋比例的增加，對照組與配方組精子活力、質膜完整率及頂體完整率均呈現先增加后下降的趨勢。但配方組對原精采用10倍稀釋，保存第3天時，精子活力仍達到60%，質膜完整率為82%，頂體完整率為87%，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。表明配方組的海藻酸鈉、果糖和甘氨酸有效成分，不僅可以滿足高倍稀釋精子的營養需要，而且能夠較好地降低精液高倍稀釋過程所受稀釋打擊，對精子具有一定保護作用。這可能與海藻酸鈉常溫條件下能夠形成凝膠從而避免蛋白、細胞和酶等活性物質的失活的理化性質相關；羅光彬等人研究發現甘氨酸對冷凍保存精子活力具有較好的維持作用[12]，表明甘氨酸對精子的體外保存也具有一定積極影響，另外，果糖作為精漿的有效組成成分之一，不僅能夠直接被精子利用，而且對于精子活力的維持、頂體保護也具有一定作用。這與深林松等人認為果糖對精子運動性能有利的試驗結果相一致[13]。綜上，本課題組研發的豬精液稀釋劑可以對豬原精進行10倍左右的稀釋，大大提高了優秀種公豬精液利用率。

表1 不同稀釋倍數精子有效保存時間

表2 不同稀釋倍數對豬精子質膜完整性的影響

表3 兩種稀釋劑在不同稀釋倍數時對精子頂體完整性的影響