響應曲面法優化黑豆丹貝固體發酵條件的研究

武悅，王坤，牛廣財，趙婧，朱丹

(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319)

丹貝(tempeh)又稱天培、天貝，是源于印度尼西亞的一種大豆發酵類食品，被當地人作為主食。它是將大豆經過浸泡、脫皮、蒸煮、調酸和接種少孢根霉發酵而成的具有白色菌絲的餅狀物[1,2]，因其風味獨特、營養豐富、價格低廉和制作簡易而備受民眾喜愛。丹貝現已躋身于世界高檔食品市場，且有成為全球化食品的趨勢[3]。

丹貝的生產一般采用自然發酵和純種發酵方法。雖然純種發酵的丹貝質量不及天然發酵產品，但是它容易控制，產品質量穩定。因此，純種發酵方法應用較多[4]。由于丹貝發酵是微生物生長及其產物形成的一系列酶促反應過程，發酵原料(底物)、發酵時間、接種量和pH等因素都會影響少孢根霉的生長和最終發酵產品的品質[5]。劉全德等以氨基氮含量為主要評價指標，結合感官評分，確定多菌種發酵制作丹貝的前發酵工藝條件為：在蒸煮大豆基質中加入3%的米粉，接種3%的乳酸菌，于42 ℃發酵2.5 h至pH值5.0，再加入5%的少孢根霉∶甜酒曲為3∶2的混合菌，于37 ℃下發酵18 h[6]。周思靜等以大豆為原料，少孢根霉為發酵菌株，制備高活性β-葡萄糖苷酶丹貝的發酵工藝為：蒸煮時間20 min、接種量1.50%、發酵時間36 h的條件下β-葡萄糖苷酶活性最高，為345.63 U[7]。

目前，丹貝生產主要以大豆為原料，但也有研究采用其他豆類或豆類副產物為原料制作丹貝，如蠶豆、鷹嘴豆、油菜籽餅、玉米-大豆混合物、豆渣等[8-12]。黑豆又稱烏豆、黑大豆，我國東北地區出產最多，黑豆中含有葉綠素和黑色素等花色苷類物質，黑豆的營養價值和藥用價值均高于普通大豆[13]，是急需開發的黑色食品資源之一。因此，本研究以黑豆為主要原料，通過響應曲面法對黑豆丹貝的發酵工藝進行優化，從而得到最佳發酵條件，不僅能豐富丹貝的種類，還能為黑豆功能性食品的開發提供理論依據，解決了黑龍江省地產黑豆精深加工不足的問題，也為其他原料的開發利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑豆：購于黑龍江省建三江農場；食品級乳酸：購于鄭州高研生物科技有限公司；少孢根霉(Rhizopusoligosporus)：購于南京天貝人發酵技術有限公司，孢子數量在106個/g以上。

1.2 主要儀器

電磁爐、電蒸鍋 廣東美的生活電器制造有限公司；電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；LRH-150型生化培養箱 上海益恒實驗儀器有限公司；DL-CJ-1N型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；L420臺式低速自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 丹貝生產工藝流程及操作要點

1.3.1.1 丹貝生產工藝流程

1.3.1.2 操作要點

選用顆粒飽滿的黑豆，去除劣豆，用清水洗凈，黑豆∶水為1∶3 (m/V)，室溫浸泡使其易于脫皮。浸泡時間24 h，然后將豆粒置于電蒸鍋中蒸熟蒸透，至松軟無硬芯即可。在超凈工作臺中冷卻至室溫后，添加適量的乳酸混勻，接種少孢根霉菌粉并混合均勻，裝入扎孔的發酵袋(8 cm×12 cm)中，置于恒溫培養箱中發酵。

1.3.2 單因素試驗設計

1.3.2.1 發酵時間對丹貝品質的影響

在接種量0.25%、乳酸添加量1.0%、發酵溫度34 ℃的條件下，研究發酵時間(24，30，36，42，48 h)對丹貝品質的影響。

1.3.2.2 發酵溫度對丹貝品質的影響

在接種量0.25%、乳酸添加量1.0%、發酵時間30 h的條件下，研究發酵溫度(28，31，34，37，40 ℃)對丹貝品質的影響。

1.3.2.3 少孢根霉接種量對丹貝品質的影響

在乳酸添加量1.0%、發酵溫度31 ℃、發酵時間30 h的條件下，研究少孢根霉菌粉接種量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)對丹貝品質的影響。

1.3.2.4 乳酸添加量對丹貝品質的影響

在接種量0.25%、發酵溫度31 ℃、發酵時間30 h的條件下，研究乳酸添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%)對丹貝品質的影響。

1.3.3 響應曲面試驗設計

根據單因素試驗結果以及Box-Benhnken的中心組合設計原理，選擇發酵時間、發酵溫度、接種量、乳酸添加量4個因素，以感官評分為指標，對黑豆丹貝的發酵工藝進行優化，其因素水平表見表1。

表1 響應曲面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 產品感官評定

黑豆丹貝的感官評分方法見表2。

表2 黑豆丹貝的感官評分方法Table 2 Sensory evaluation method of black soybean tempeh

1.3.4.2 其他指標測定

氨基酸態氮：采用GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》；還原糖：采用3,5-二硝基水楊酸法；可溶性蛋白質含量：考馬斯亮藍G-250染色法[14]。大腸菌群計數：采用GB 4789.3-2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》；菌落總數：采用GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》。

2 結果與分析

2.1 發酵時間對黑豆丹貝品質的影響

發酵時間過短，菌種生長不佳，制備的丹貝質量較差；時間過長，容易產生不良氣味，所以選擇合適的發酵時間至關重要。

圖1 發酵時間對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation time on sensory score of black soybean tempeh

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，感官評分呈先升高后降低的趨勢。當發酵時間為24 h時，丹貝表面菌絲過少，豆瓣松散，無香味；當發酵至36 h時，豆瓣表面菌絲致密，香味醇正，無異味，此時感官評分最高，為83.6；當發酵時間超過42 h時，丹貝的品質開始下降，表面有黑色孢子和不良氣味產生。因此，發酵時間在30～42 h時，丹貝的品質較好。

2.2 發酵溫度對黑豆丹貝品質的影響

發酵溫度對丹貝品質的影響較大，見圖2。

圖2 發酵溫度對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score of black soybean tempeh

由圖2可知，當溫度為28 ℃時，豆瓣表面菌絲過少，豆瓣松散，丹貝的品質較差，感官評分很低；當溫度為31～34 ℃時，黑豆丹貝的菌絲較致密，部分豆瓣松散，香味較濃；當溫度大于37 ℃時，丹貝發酵溫度偏高，開始有少量孢子產生，顏色偏黃并伴有腐敗氣味。以感官為評定指標，可得出發酵溫度為34 ℃時，丹貝的品質最佳。因此，發酵溫度在31～37 ℃時，丹貝的品質較好。

2.3 接種量對黑豆丹貝品質的影響

接種量是影響丹貝品質的重要因素之一，接種量過少，菌絲生長緩慢，分解蛋白質不完全，無法形成完整、致密的糕團狀；接種量過高，會因過度分解蛋白質而有輕微腐敗氣味，且會產生孢子，從而影響產品的外觀和氣味。

圖3 接種量對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on sensory score of black soybean tempeh

由圖3可知，在接種量在0.20%～0.30%時，黑豆丹貝的感官評分較高。

2.4 乳酸添加量對黑豆丹貝品質的影響

添加乳酸不僅可以為少孢根霉的生長提供適宜的環境，還可以抑制其他雜菌的生長。

圖4 乳酸添加量對黑豆丹貝感官評分的影響Fig.4 Effect of the additive amount of lactic acid on sensory score of black soybean tempeh

由圖4可知，感官評分隨著乳酸添加量的增加呈先增高后降低的變化。當乳酸添加量為0.5%時，酸度較低不利于菌絲的生長，且伴有腐敗氣味，可能是由于雜菌生長所致；當乳酸添加量在1.5%時，基質的酸度適合少孢根霉的生長，發酵后黑豆丹貝的表面菌絲致密，呈乳白色糕團狀，質地結實有彈性，香味濃郁，產品質量好；當乳酸添加量大于2.0%時，可能是基質過酸抑制了少孢根霉的生長，丹貝品質較差。因此，乳酸添加量在1.5%左右時，黑豆丹貝的品質較好。

2.5 響應面法優化試驗

2.5.1 模型建立及顯著性分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件，對表3試驗結果進行二次多項回歸擬合，得到以產品感官評分為響應值，發酵時間(A)、發酵溫度(B)、接種量(C)和乳酸添加量(D)之間的回歸方程為：Y=87.72+2.57A+1.28B+3.84C+11.03D-2.05AB+3.83AC+4.07AD-2.57BC+3.75BD-2.42CD-6.73A2-5.96B2-5.94C2-7.43D2。

表3 響應曲面試驗方案及結果Table 3 Design and result of response surface experiment

續 表

表4 響應面回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4可知，回歸模型高度顯著(P<0.0001)，而失擬項不顯著(P=0.0971>0.05)，決定系數R2=0.9325，表明該模型對試驗擬合度較好，試驗誤差較小，可以用此模型進行分析和預測。由F值可知各因素對產品感官評分影響的主次順序為：D>C>A>B，即乳酸添加量>接種量>發酵時間>發酵溫度。交互項AD的P<0.05，AB、AC、BC、BD和CD的P>0.05，因此，A(發酵時間)和D(乳酸添加量)的交互作用顯著，其他因素的交互作用不顯著。

2.5.2 響應曲面分析

響應曲面圖能直觀反映發酵時間和乳酸添加量對黑豆丹貝感官評分影響的整體趨勢，等高線形狀可以反映交互作用大小，其排列的密集程度表明發酵時間和乳酸添加量變化對產品感官評分的影響程度[15]。

圖5 發酵時間和乳酸添加量的響應曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of fermentation time and additive amount of lactic acid

由圖5可知，在接種量和溫度不變的情況下，固定發酵時間，黑豆丹貝的感官評分為先陡峭上升到達最大值后再緩慢下降，表明乳酸添加量對丹貝的感官品質影響較大，且在較低水平下對丹貝感官質量的影響比高水平突出。同時，等高線呈橢圓形，說明發酵時間和乳酸添加量的交互作用顯著。

2.5.3 驗證試驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到最優的理論條件為：發酵時間39 h，發酵溫度34.75 ℃，接種量0.26%，乳酸添加量1.45%，模型預測感官評分值為94.51分。考慮到實際操作的便利，將參數修整為：發酵時間39 h，發酵溫度35 ℃，接種量0.26%，乳酸添加量1.5%。采用上述條件進行實際發酵，做3次試驗取其平均值，得到感官評分為93.9分，與預測值差異不顯著，表明模型擬合程度較好，可以用該發酵條件制作黑豆丹貝。

2.6 黑豆丹貝產品指標

2.6.1 感官指標

色澤質地：呈白色糕團狀，結實有彈性；香氣：香味濃郁，氣味純正；滋味：酥軟細膩。

2.6.2 理化指標

氨基酸態氮：0.87 g/100 g；還原糖16.42 mg/g；可溶性蛋白：61.59 mg/g。

2.6.3 微生物指標

菌落總數≤2×103CFU/g，大腸桿菌總數<30 MPN/100 g，致病菌未檢出。

3 結論

在單因素試驗的基礎上通過響應曲面優化，獲得黑豆丹貝固體發酵的最佳工藝條件為：發酵時間39 h，發酵溫度35 ℃，乳酸添加量1.5%，接種量0.26%，此時產品的感官評分為93.9分。回歸分析和驗證試驗表明本試驗優化的黑豆丹貝發酵工藝條件切實可行，為黑豆丹貝的產業化奠定了基礎。