正交試驗優化產地鮮制法半夏工藝研究

金蓋宇，王海燕,李 娟,楊俊杰，熊之萍

中藥半夏來源為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit的干燥塊莖。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結之功效[1]。生半夏有毒，內服時需要炮制后才能入藥。法半夏是《藥典》規定品種，燥濕化痰力強，用于各類痰證。《藥典》規定的法半夏炮制方法非常籠統，對甘草和石灰水的比例和用量沒有明確要求，炮制時間也無詳細規定。因此，各地炮制的法半夏質量參差不齊，療效有很大差別。文獻研究法半夏的主要指標性成分為半夏總生物堿和甘草酸[2]。本試驗直接采用產地新鮮半夏為原料，加輔料炮制制備法半夏，采用正交試驗設計法，以總酸(2015年版一部半夏含量測定項下指標)、總生物堿和甘草酸含量的綜合作用為指標，對法半夏產地炮制方法進行研究，并以草酸鈣針晶含量和家兔眼結膜刺激性試驗評價法半夏的炮制減毒作用，以期為法半夏的產地加工提供技術指導。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料與試劑 新鮮半夏藥材購于信陽市息縣半夏種植基地，經信陽農林學院周巍教授鑒定為半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit的塊莖；甘草(亳州市滬譙藥業有限公司，批號1505502)；琥珀酸對照品(中國藥品生物制品檢驗所，批號896-200001)；鹽酸麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢驗所，批號171241-200506)；甘草酸單銨鹽對照品(中國藥品生物制品檢驗所，批號110731-9202)；草酸基準試劑(購自河南省藥品檢驗所)；純化水自制；甲醇為色譜純(天津四友)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 L600-DP6高效液相色譜儀(北京普析通用儀器有限責任公司)；TU-1810紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；ZD-3A型電位滴定儀(南京遠拓)；梅特勒AB135-S電子分析天平(上海樹信儀器儀表有限公司)；SCQ-8201E超聲清洗儀(上海聲彥超聲波儀器設備有限公司)。

1.3 大耳白種家兔，雌雄不限，體重(1.5±0.2)kg,雙眼正常，由信陽農林學院藥理實驗室提供。

2 方法與結果

2.1 總酸的含量測定 樣品粉碎過四號篩，取粉末5g，精密稱定，加95%乙醇50mL,加熱回流1小時，過濾，再重復操作2次，合并濾液，蒸干。殘渣加入0.1mol·L-1NaOH滴定液10mL溶解，超聲處理(功率500w,頻率40kHz)30 min，用蒸餾水定容至50mL。精密量取25mL，照電位滴定法(附錄ⅧA)測定，用鹽酸滴定液(0.1mol·L-1)滴定，并將滴定的結果用空白試驗校正。根據有機酸消耗NaOH滴定液(0.1mol·L-1)的體積，計算有機酸含量。每1mL氫氧化鈉滴定液(0.1mol·L-1)相當于5.904mg的琥珀酸(C4H6O8)[3]。

2.2 總生物堿的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品適量，用氯仿溶解，制得濃度為0.0632mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 標準曲線的繪制 分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12mL置于分液漏斗中，分別加蒸餾水10mL，pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液10mL，氯仿10mL，0.1%溴麝香草酚藍溶液1mL，充分振蕩，放置30min，取氯仿層作為供試樣品。另取1mL水用同樣方法制備空白對照液。在417nm波長測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，求得回歸方程為A=0.1548C+0.0057，r=0.9996(n=6)，表明鹽酸麻黃堿在9.72～32.97μg·mL-1呈良好的線性關系。

2.2.3 供試品溶液的測定 取法半夏粉末5g,精密稱定，置于50mL三角瓶中，加入12%氨水適量，將樣品攪拌至濕潤，加入氯仿100mL，浸泡12h，超聲提取40min，過濾，殘渣以10mL氯仿分3次洗滌，合并濾液與洗液，用氯仿稀釋至刻度，搖勻，取提取液10mL，濃縮至干，加入pH6.0緩沖液5mL，氯仿10mL，0.1%溴麝香草酚藍溶液1mL，充分振蕩，移至50mL分液漏斗，靜置30min，分取氯仿層，在417nm波長測定吸光度，計算，即得[4]。

2.3 甘草酸含量測定

2.3.1 色譜條件 PM952505-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙酸銨(0.2mol·L-1)-冰醋酸(67∶33:1)為流動相；檢測波長為250nm。

2.3.2 對品溶液的制備 精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，用流動相配制成0.3mg·mL-1的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 稱取法半夏1g，精密稱定，置25mL錐形瓶中，加流動相8mL，超聲處理1h，放冷，置于10mL容量瓶，用流動相定容。

2.3.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液5～10μL，注入液相色譜儀，測定，即得[5]。

2.4 炮制工藝的正交試驗設計

2.4.1 因素-水平表 以總酸、總生物堿和甘草酸含量為指標，以L9(34) 正交表進行設計，對甘草：石灰、炮制溫度、炮制時間和浸液pH進行考察。因素-水平見表1。

表1 因素-水平表

2.4.2 正交試驗結果 取半夏鮮藥材200 g，按正交表中炮制方法制得法半夏，測定總酸、總生物堿和甘草酸含量。正交試驗設計結果如表2所示。

表2 正交試驗設計結果

綜合分=(X/Xmax)×35%+(Y/Ymax)×35% +(Z/Zmax)×40% X:總酸含量 Y：總生物堿含量 Z：甘草酸含量

對正交設計試驗結果進行直觀分析，可知各因素影響的主次順序為：甘草：石灰>炮制時間>浸液pH>炮制溫度。在考察范圍內，炮制工藝的最佳條件可選擇為：A3B2C1D1。

表3為方差分析結果，由F值可知甘草、石灰用量比有顯著性影響。結合實際，確定炮制方法為：甘草：石灰比例15:10，炮制時間為2d，pH值為12，炮制溫度為30℃。

表3 方差分析表

2.5 法半夏毒性試驗

2.5.1 對照藥材制備 取同批鮮半夏，置烘箱50℃干燥，干燥品即為生半夏。取生半夏按照藥典規定方法進行加工，干燥，得到藥典法半夏品。

2.5.2 草酸鈣針晶含量測定 色譜條件：ODS-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱；流動相0.5%KH2PO4-0.5mmol/L TBA水溶液(pH=2.0),以磷酸調節pH值，檢測波長254nm。

對照品溶液制備 精密稱取草酸對照品適量，用蒸餾水配制成濃度為0.2mg/mL的對照品溶液，即得。

供試品溶液制備 分別精密稱取生半夏、優選法半夏和藥典法半夏粉末(60目)各0.1g，置玻璃容器中，加入3mL蒸餾水混勻，振蕩5min，置60℃水浴加熱并攪拌10min，3000r·min-1，離心5min,殘渣以熱純水洗滌2次，每次2mL，混勻離心，取藥材殘渣，加0.2mL HCl(1:1)溶液，3.0mL純水混勻，置70℃水浴，邊攪拌邊加熱10min，離心(條件同上)，分離沉淀于上清液，沉淀用0.1mol·L-1HCl，同上法處理2次，每次2mL，離心，合并上清液，置10mL量瓶，純水定容至刻度，即得。

測定分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液5～10μL，注入液相色譜儀，測定，即得[6]。

將所得數據用SPSS23.0軟件進行處理，進行單因素方差分析。結果如表4所示。

表4 草酸鈣針晶含量試驗結果

由表4可知，優選法半夏和藥典法半夏都能顯著降低刺激性成分草酸鈣針晶的含量，而優選法半夏和藥典法半夏之間的草酸鈣針晶含量差別不明顯。

2.5.3 家兔眼結膜刺激性試驗 取家兔隨機分組，將20%生半夏混懸液、20%優選法半夏混懸液、20%藥典法半夏混懸液分別滴入兔左右眼中，每組樣品用兔眼6只，每只眼給藥兩滴。給藥后，閉合眼瞼5～10s，2min后立即用40～50mL生理鹽水沖洗眼睛至眼中無任何異物，隨后1.5～3h內觀察兔眼情況，根據刺激情況打分[6]。將所得數據用SPSS23.0軟件進行處理，進行單因素方差分析。結果如表5。

表5 家兔眼結膜刺激性試驗(n=6)

由表5可以看出，優化法半夏和藥典法半夏與生半夏比較均可以顯著降低半夏的刺激性，二者差別不大。

3 討 論

關于法半夏加工方法的研究，到目前為止尚未見到產地鮮制法半夏的報道，本研究填補這方面的空白。本試驗以正交試驗表設計產地鮮制法半夏的炮制工藝，對加工過程中生石灰、甘草用量比、炮制溫度、炮制時間和浸液pH值進行考察，并采用綜合評分和方差分析進行工藝優選。得到產地鮮制法半夏的炮制工藝為：室溫，每100g鮮半夏，用甘草15g,生石灰10g，浸泡2d，保持浸液pH12以上。較藥典法顯著縮短了加工時間，提高了生產效率，并量化了各工藝參數，為法半夏的產地加工提供技術指導。但干燥方法或干燥溫度是否影響法半夏中有效部位含量和法半夏質量，還有待進一步研究。本試驗還評價了優化法半夏的炮制減毒作用，結果表明用本試驗確定的優化法半夏較生半夏，草酸鈣針晶含量顯著降低，家兔眼結膜刺激性試驗中刺激程度也顯著減小；與藥典法半夏比較，草酸鈣針晶含量和家兔眼結膜刺激性一致，同樣達到了減毒的目的。

本研究確定的法半夏加工方法操作簡單，對加工設備、技術要求低，易于普及，且法半夏飲片質量重現性良好，可為有關部門制定法半夏飲片炮制品標準提供參考。