熱激對大花蕙蘭褐變總酚及相關酶活性的影響

葛 坤，方 巖，王智慧，楊 旭，薛 斌

（太原學院園林科研所，山西太原030024）

大花蕙蘭因植株挺拔，花姿秀美，花色艷麗而備受人們喜愛。植物組培技術作為大花蕙蘭一種主要的繁殖方式，已日漸成熟，但褐變問題在大花蕙蘭組培過程中普遍存在，這不僅制約了原球莖誘導愈傷組織分化，嚴重時會導致外植體死亡，大大降低了大花蕙蘭組培的增殖率[1]。鄭迎冬等[2]以大花蕙蘭幼嫩莖段為外植體，原球莖的誘導率很低，僅為30%。陳建科等[3]用幼嫩葉片作為組培外植體，并在培養基中增加了無機鹽濃度來抑制褐變。

最新研究表明，對葉片外植體進行熱激處理、水楊酸處理等可降低褐變程度[4]。大多數研究人員將熱激處理可降低組培褐變歸因于熱激處理抑制了PAL活性，PAL是酚類物質合成的關鍵酶，故熱激處理使得酚類物質大大減少[5]。楊谷良等[6]通過對寶華甜柿葉片外植體進行熱激處理，降低了褐變率。楊玲等[7]分析了熱激處理對蝴蝶蘭組培褐變的影響，并通過正交試驗篩選了適宜的熱激處理條件。

本研究以大花蕙蘭組培瓶苗為試材，比較熱激處理與未熱激處理的葉片外植體褐變程度，通過分析熱激處理對總酚合成及PAL、PPO、POD活性的影響，以揭示熱激處理對大花蕙蘭組培褐變有效抑制的生理機制，為大花蕙蘭組培繁殖的生產提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為北京園林科研所培養的大花蕙蘭瓶苗，該瓶苗已進行生根培養6個月，培養基為1/2 MS＋IBA0.5 mg/L＋活性炭1.0 g/L，pH值為5.7。

1.2 試驗方法

將部分已生根未褐變的瓶苗進行45℃熱激處理，即在電熱恒溫鼓風干燥箱中加熱至瓶內溫度達到45℃時停止，處理時間因各實驗室溫度不同而有差異。選擇已熱激處理及未經處理（CK）的瓶苗各100瓶，葉片切割為0.8 cm×0.8 cm，接種于MS＋6-BA 5.0 mg/L（pH值5.6～5.8）培養基上進行增殖繼代培養，接種前經熱激處理的瓶苗于自然光照培養架上恢復5～6 h。每瓶接種3個外植體，溫度25℃，光照2 000～3 000 lx，光照時間12 h/d。接種后第0，3，6，9天進行取樣，用蒸餾水將樣品培養基沖洗干凈后用濾紙擦干，放入干燥預冷研缽中，并迅速倒入液氮冷凍，研磨成粉末封袋，保存于-80℃低溫冰箱內，待測生理指標，取樣需重復3次。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法，參考文獻[8]的測試法。稱取樣品2.0 g，置于圓底燒瓶，用甲醇定容至50mL。超聲振蕩30min后靜置24h。用50 mL 50%甲醇加熱回流1 h，抽濾，將濾渣加入50 mL 50%甲醇再次回流1 h，抽濾，將2次濾液合并定容至50 mL。移液管吸取沒食子酸0.2 mL，加入1.0 mL磷鉬酸試劑，后加入15 mL5%碳酸鈉溶液，攪拌30 min后，在波長765 nm處比色測定OD值。以沒食子酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，建立標準曲線。將樣品替代沒食子酸，按以上步驟測定OD值，平行3次，將平均值代入線性回歸方程，計算樣品中總酚含量（mg/g）。

1.3.2 PAL活性測定 參照SOLECKA等[9]的方法。底物酚類物質合成時，經歷苯丙烷代謝途徑，催化L-苯丙氨酸發生脫氨反應形成反式肉桂酸，同時釋放NH3。稱取樣品0.1g，加入0.01gPVP，0.1 mol/L硼酸緩沖液1 mL（pH值8.8），5 mol/L疏基乙醇，于預先干燥的研缽中研磨成勻漿，離心15 min，轉速為10 000 r/min，取上清液作為酶提取液。反應液總體積4 mL，吸取0.2 mL酶液（另0.2 mL緩沖液作為對照），加入0.02 mol/L苯丙氨酸1 mL，蒸餾水2.8 mL，恒溫30℃，水浴攪拌30 min。采用紫外可見分光光度計測吸光度，波長為290 nm，吸光度值每變化0.01，表示生成1 μg反式肉桂酸，即為一個酶活性單位，用U/g來表示。

1.3.3 PPO活性測定 PPO是一種含有銅離子的氧化還原酶，催化酚類物質生成褐色醌類物質，故此種酶是引起植物褐變的關鍵酶。當植物受到機械損傷時，它存在于植物線粒體、葉綠體等細胞器、細胞壁和細胞膜上[10]。稱取2.0 g樣品，加入10 mL 0.1 mol/L的 PPS緩沖液（pH 值 6.0），0.5 g PVPP，于干燥研缽中研磨成勻漿，低溫下離心15 min，轉速為1 100 r/min，制得酶提取液。吸取3 mL0.05 mol/L PPS緩沖液（pH值6.0），加入1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚，后再加入0.1 mL酶提取液，于525 nm處比色測定OD值，以蒸餾水作參比對照。OD值每分鐘變化0.01為一個PPO酶活單位（μmol/（mg·min））。

式中，ΔA為吸光值在反應時間內的變化，W為樣品質量，t為反應時間，D為稀釋倍數。

1.3.4 POD活性測定 參考王學魁等[11]的愈創木酚法。取50mL100mmol/L的磷酸二氫鈉（NaH2PO4）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4）緩沖液，加入 28 μL愈創木酚溶液，振蕩使其混合均勻，加入30%的H2O2溶液作為反應混合液。稱取樣品1.0 g至干燥研缽中，分別加入1 mL NaH2PO4和Na2HPO4緩沖液研磨。將研磨后的勻漿于4 000 r/min離心15 min，取上清液加入NaH2PO4和Na2HPO4緩沖液定容至100 mL。分別取1mL上述溶液，即1 mLNaH2PO4和Na2HPO4緩沖液，并分別加入3 mL預先配制好的反應混合液，紫外分光光度計中比色，波長為470nm。每1min讀數一次，共讀數5次，以每分鐘ΔA470變化0.01作為一個酶活性單位（nmol/（mg·min））。

式中，ΔA470為波長在470 nm下，每1 min所讀取的OD值；VT為酶液總體積；W為樣品質量；VS為比色時吸取酶液體積；t為反應時間。

1.4 數據分析

數據相關性分析采用SAS8.0軟件，圖中標準誤來自樣本的3個重復。用Word process system of fice軟件進行誤差分析，作圖采用Orihin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 熱激處理對大花蕙蘭組培褐變的影響

從圖1可以看出，大花蕙蘭外植體增殖繼代培養期間，未經熱激對照處理的外植體全部變成深褐色，且面積很大，經過熱激處理的外植體略微變色，即未經熱激對照處理的外植體褐變程度遠高于熱激處理的外植體，由此判斷，熱激處理對大花蕙蘭組培褐變有抑制作用。

2.2 熱激處理對大花蕙蘭組培褐變過程中總酚含量及酶活性的影響

2.2.1 總酚含量 酶、底物、氧是導致外植體褐變的主要因素，酚類物質即是引起褐變的酶促底物。由圖2可知，未經熱激對照處理組總酚含量變化相對平緩，熱激處理后使大花蕙蘭外植體的總酚含量逐漸降低。在第3，6，9天的外植體總酚含量比未經熱激對照處理分別降低58.42%，67.21%，70.16%。

2.2.2 PAL活性 PAL活性變化情況如圖3所示。

從圖3可以看出，第3，6，9天抽取的樣品經熱激處理的外植體PAL活性比未經熱激對照處理低，其中，第3天抽取的降低了18.58%，降低幅度最大，第6，9天經熱激處理的PAL活性比未經熱激對照處理分別降低13.3%，10.47%。

2.2.3 PPO活性 由圖4可知，經熱激處理的外植體PPO活性始終低于未經熱激對照處理，由此得出，熱激處理對外植體PPO的活性有顯著抑制作用，第6天抽取的樣品中經熱激處理的外植體PPO活性比未經熱激對照處理低64.47%，第0，3，9天分別降低了36.94%，14.85%，29.38%。

2.2.4 POD活性 從圖5可以看出，熱激處理對外植體POD活性雖然有一定的抑制作用，但是不顯著。前3 d抽取的樣品經熱激處理的外植體POD活性比未經熱激對照處理略有下降，第6，9天抽取的樣品經熱激處理的外植體POD活性比未經熱激對照處理顯著升高。第0，3天抽取的樣品經熱激處理的外植體POD活性比未經熱激對照處理分別降低22.85%，21.14%，第6，9天POD活性分別升高51.85%，38.7%。

2.2.5 總酚含量與PAL、PPO和POD活性的相關性分析 大花蕙蘭葉片外植體總酚含量與3種酶活性相關性如表1所示，與PAL的相關系數為0.529 37，與PPO的相關系數為0.622 94，與POD的相關系數為-0.530 01。即PAL活性與總酚含量呈正相關，PPO活性與總酚含量也呈正相關，且相關性最大，POD活性與總酚含量呈負相關。

表1 總酚含量與PAL、PPO和POD活性的相關性分析

3 討論

蘭科植物組培過程中，外植體從原球莖誘導到繼代增殖，極易發生褐變[12]。褐變是植物細胞液泡內的酚類物質與細胞質內的酚氧化酶在外植體受到機械損傷，而使二者經氧催化發生酶促氧化反應，形成褐色的醌類物質和水，而醌類物質經酪氨酸酶催化，導致外植體蛋白質發生聚合反應，最終使培養基變成褐色，外植體組織死亡[13]。在控制植物組培褐變的多種途徑中，熱激處理因安全、簡便已被多數研究中心應用。熱激處理是將植物外植體在超過其正常生長溫度范圍內，處理一段時間后，誘導產生熱激蛋白（Heat shot protein，HSP），此蛋白可以保護植物體免受傷害[14]。KANABUS等[15]將馬鈴薯細胞經過熱激處理（42℃）后，大量HSP合成，而使細胞內其他蛋白的合成受到抑制?？偡雍考癙AL、PPO、POD活性是確定褐變程度的重要指標[16]。PAL是酚類物質合成的關鍵酶，植物細胞中，葡萄糖經莽草酸途徑生成L-苯丙氨酸，后經過苯丙烷代謝途徑生成酚類物質。故PAL活性與酚類物質的合成有著密切的聯系[17]。本研究顯示，熱激處理明顯減輕了大花蕙蘭葉片外植體的褐變程度。培養初期0～6 d，經過熱激處理的外植體PAL活性及總酚含量低于未經熱激對照處理。由此表明，熱激處理可抑制由機械損傷引起的大花蕙蘭葉片外植體的PAL活性。因熱激處理誘導產生熱激蛋白在細胞總蛋白合成一定的情況下，降低了PAL合成的誘導蛋白，PAL的代謝速率加快，PAL活性受到抑制，進而降低了總酚的合成，減少醌類物質產生，減輕了褐變。

酚類物質由PAL合成后經PPO催化降解引起褐變[18]。FUKUMOTO等[19]將鮮萵苣經熱激處理（50℃）后，測得PPO和POD合成受到抑制，降低了其活性。PPO屬于末端氧化酶，在植物中廣泛存在[20]。POD屬于氧化還原酶，在外植體褐變過程中，POD還原H2O2，為PPO降解酚類物質提供了所需氧氣[21]。本試驗中，經熱激處理的大花蕙蘭葉片外植體PPO活性低于未經處理的，而POD活性未得到持久抑制。這表明，在大花蕙蘭組培中，PPO是催化酚類物質形成醌類物質的主要酶。

綜上所述，熱激處理可抑制組培期間葉片外植體PPO與PAL的活性，抑制了酚類物質的氧化合成，進而減少了褐化物醌類物質的產生，從而降低了大花蕙蘭葉片外植體褐變的發生。在總酚合成與3種酶相關性分析中可看出，總酚含量與PPO活性呈顯著正相關，與POD活性呈負相關。