基于16S rDNA高通量測序的玉米根際與非根際土壤細菌多樣性比較

徐麗霞，何永吉

（1.山西藥科職業學院中藥系，山西太原030031；2.山西省農業科學院農產品加工研究所，山西太原030031）

根系是植物和土壤之間物質和能量的重要界面，也是土壤微生物活動最活躍的部分[1-2]。植物根系特定分泌物和土壤養分相互作用形成了獨特的養分組成和微生物群落組成。有研究表明，玉米、大針茅和刺槐根際土壤中的有效氮（AN）、有效磷（AP）和有機碳（SOC）含量明顯高于非根際土壤[1-4]；在刺槐的研究中發現，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度在根際土壤中高于非根際土壤[4-5]。土壤細菌是土壤生態系統的重要組成部分，占土壤微生物總量的90%以上。植物根際土壤細菌參與了有機質的形成和轉化，N、P和K的循環以及植物激素和抗生素的分泌，為植物免受病原體侵害和植株健康生長提供了保障[6]。

玉米（Zea maysL.）作為我國一種重要的糧食作物，廣泛種植于全國各地，產量居糧食作物第一[7-9]。近年來，玉米種植中化肥的施用不僅提高了土壤中N、P和K的含量，也改變了根際土壤細菌群落的結構；但關于玉米根際土壤養分與細菌多樣性的關系的研究甚少。

本試驗應用高通量測序技術對玉米根際和非根際土壤細菌的16S rDNA的V3-V4可變區進行分析，研究N、P、K和有機肥配合施肥條件下，玉米根際和非根際土壤細菌多樣性的差異，以探究玉米根際土壤養分與特定細菌類群的關系，為尋找玉米根際土壤中利于養分循環的細菌類群提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

試驗在山西省晉中市東陽鎮試驗田進行。該地區位于北緯 37°35′，東經 112°51′；年平均氣溫為9.7℃，降水量為440.7 mm。試驗進行前，所有地塊均種植玉米。播種前施基肥：尿素141 kg/hm2、重過磷酸鈣141 kg/hm2、硫酸鉀145 kg/hm2和有機肥3 000 kg/hm2。其中，有機肥為豬糞，含水55%、總氮16.5 g/kg、P2O523.6 g/kg 和 K2O 15.8 g/kg；7 月底追施尿素100 kg/hm2。每個試驗處理設3個重復小區，每小區50 m2，行距和株距分別為70，25 cm。

1.2 土壤樣品的采集

2018年7月追肥前，分別在3個小區隨機采集玉米15株，先輕輕抖落根系外圍土壤作為非根際土壤（NRS）；再用毛刷輕輕刷下根表面土壤，均勻混合15株玉米根際的土壤視作根際土壤（RS）?；旌蠘悠贩謩e過0.5 mm篩，并分為2份，其中一份風干用來測定土壤養分；另外一份保存于-80℃用于土壤細菌多樣性檢測。

1.3 土壤養分含量的測定

采用堿解擴散法測定裂解氮（AN）含量；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法測定有效磷（AP）含量；采用乙酸銨浸提-原子吸收分光光度法測定有效鉀（AK）含量；采用凱氏定氮法測定全氮（TN）含量；采用堿熔-鉬銻抗分光光度法測定全磷（TP）含量；采用氫氧化鈉熔融-火焰原子吸收分光光度法測定全鉀（TK）含量；采用重鉻酸鉀外加熱法測定有機碳（SOC）含量[10]；用SOC/TN表示土壤碳氮比（C/N）。

1.4 土壤DNA提取和細菌多樣性檢測

使用土壤DNA試劑盒（USAE.Z.N.A.R）從0.5 g土壤中提取DNA。采用細菌通用引物338F：5′-AC TCCTACGGGAGGCAGCA-3′和 806R：5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′擴增土壤樣品細菌16S rDNA的V3-V4可變區，并用Illumina技術進行測序[11]。PCR 條件為 94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，71℃30 s，25個循環；71℃5 min。原始數據質量控制過程中，丟棄模糊堿基和低質量序列，最終序列長不能低于150 bp。對過濾后的序列進行連接，連接后的序列不低于10 bp，并去除嵌合體和錯配堿基[12]。在序列相似度97%的情況下，將高質量序列聚類為Operational Taxonomic Unit（OTU），用于種群分類。

1.5 數據分析

通過尋找最近祖先的方法，獲得每個樣品的OTU分類信息。使用Qime將修剪序列與Green Gene數據庫進行比較，以對每個分類群進行豐度計算和分類，并進行分類到屬級別的OTU豐度比較。樣本中的差異顯著性用SPSS軟件進行獨立樣本T檢驗檢測。柱形圖采用Sigmaplot繪制，*表示顯著差異（P＜0.05）；冗余分析采用Canoco5.0軟件完成；采用R軟件進行細菌群落非度量多維尺度分析。

2 結果與分析

2.1 施肥對玉米根際和非根際土壤養分含量的影響

N、P、K和C是植物生長的必需營養元素[13]，對玉米產量的形成有著重要的意義。從表1可以看出，AN、AP、SOC和C/N在根際土壤中較非根際土壤中顯著升高，分別升高26.61%，32.07%，73.32%和57.60%；而AK、TN、TP和TK在2種土壤中差異不大。

表1 不同樣品中養分含量的測定結果

2.2 施肥對玉米根際和非根際土壤細菌群落多樣性的影響

從表2可以看出，6個土壤樣品的全部測序數據包含286 028條有效序列，其中，優質序列有230 636條，占總序列的80.63%。通過數據庫比對，檢測到的有效序列主要分布在45個已知細菌門。根際土壤較非根際土壤能更確切地反映玉米根際土壤微生物的變化情況，施肥也是影響玉米根際土壤細菌群落變化的主要因素。結果表明，與非根際土壤相比，Chao和Shannon指數在玉米根際土壤中顯著升高，而Simpson指數的變化則在玉米根際土壤中顯著降低。

表2 不同樣品中土壤細菌多樣性指數和測序序列

2.2.1 施肥對玉米根際和非根際土壤細菌多樣性在門水平上的影響 在門的分類水平上，有10個細菌門，在玉米根際和非根際土壤樣品中占細菌總數的96%～97%。結果表明，與非根際土壤相比，根際土壤中Proteobacteria、Actinobacteria和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度均增加，分別增加了9.82%，5.00%和3.42%；Acidobacteria、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和浮游菌門（Planctomycetes）的相對豐度均降低，分別降低了11.73%，1.36%，2.09%和7.11%；疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠屈撓菌門（Chlor of lexi）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度在根際和非根際土壤樣品中差異不大（圖1）。

2.2.2 施肥對玉米根際和非根際土壤細菌多樣性在屬水平上的影響 從圖2可以看出，有44個屬在至少一個樣品中的相對豐度大于0.1%，且Lysobacter、Pseudomonas、Nocardioides、Bacillus、Balneimonas、Chitinophaga、Saccharothrix和Streptomyces等 37個屬的相對豐度在根際土壤中顯著高于非根際土壤，且Kribbella的豐度最大，為1.73%；Bradyrhizobium、Gemmata和Planctomyces等7個屬的相對豐度在非根際土壤中顯著高于根際土壤，其中，Planctomyces的豐度最大，為2.89%。對44個屬在2個土壤樣品中的相對豐度進行非度量多維尺度分析，結果顯示（圖3），不同的土壤樣品分別聚在一起，彼此分離，但根際與非根際土壤細菌類群間差異不顯著（F＝546.33，P＝0.1）。

2.2.3 土壤養分和細菌群落的關系 冗余分析結果顯示，土壤養分與細菌在門和屬水平上相對豐度的關系如圖4所示。由圖4-a可知，在門的水平上，第1軸和第2軸分別解釋了變量的92.58%和3.46%；Proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia和Bacteroidetes的相對豐度與AN和SOC含量及C/N呈正相關，Acidobacteria和Gemmatimonadetes的相對豐度與AP含量呈正相關。圖4-b結果顯示，在屬的水平上，第1軸和第2軸分別解釋了變量的99.32%和 0.05%；Bacillus、Chitinophaga、Pseudomonas、Lysobacter、Nocardioides、Balneimonas、Saccharothrix和Streptomyces的豐度與AN和SOC含量及C/N呈正相關；Bradyrhizobium的豐度與AK的含量呈正相關，與AN和SOC的含量及C/N呈負相關；Gemmata和Planctomyces的相對豐度與AK呈負相關，與AP呈正相關。

3 結論與討論

植物根系產生的分泌物能形成特定的根周環境及根際土壤獨特的理化性質和微生物群落分布。前人研究表明，根際土壤中AN、AP和SOC的含量提高，更有利于作物根系的吸收，并通過植物體內轉運保障作物產量穩定[1-4]，這與本試驗的部分研究結果一致。C/N＝25是土壤微生物分解有機質的最適值；C/N＞25時表明氮素缺乏；C/N＜25時可促進微生物的生長并釋放多余的氮，利于植物生長[14]本研究中，根際土壤中AN，AP和SOC含量較高時，C/N為10.85，為微生物的繁殖提供了有利的環境。

Chao和ACE指數越大說明土壤樣品中微生物物種的豐富度越高[12]；Simpson指數越大說明樣品中優勢種越多，其他非優勢物種所占的比例則會減少，群落多樣性就越低[15]。玉米根際土壤中，Chao和ACE指數在根際土壤中高于非根際土壤，Simpson指數則反之。說明根際土壤中有較高的微生物多樣性，并有一些特定的優勢菌群。

本研究表明，在門的水平，Proteobacteria和Actinobacteria的相對豐度在根際土壤中顯著高于非根際土壤。有研究表明，Proteobacteria和Actinobacteria是富營養菌，適宜生長在營養豐富的土壤中，這與根際土壤中有較高的AN、AP和SOC密切相關[16]。在屬的水平，根際土壤中Bacillus、Chitinophaga、Pseudomonas、Lysobacter、Nocardioides、Balneimonas、Saccharothrix和Streptomyces的相對豐度高于非根際土壤。前人研究發現，Bacillus具有溶解磷、固氮、降解蛋白質等生物聚合物和促進植物生長的功能[17-18]；Streptomyces能夠分泌固氮酶、植物激素IAA、多胺和抗生素[19-20]；Balneimonas被重新分類為Microvirga，而Microvirga的一些物種有固氮功能；Pseudomonas可以降解土壤中的醇、醚和農藥甲拌磷，并有助于腐殖質的形成[21-23]；Flavobacterium能分泌多種酶來降解各種碳源，形成良好的土壤環境[24]；Chitinophaga降解多糖和蛋白質分泌物[25]；Nocardioides降解多菌靈等含有苯環的有機物[26]；Lysobacter和Saccharothrix能夠分泌抗生素作為生物抑菌劑[27-28]。Bradyrhizobium和Gemmate在非根際土壤中顯著高于根際土壤，研究表明：Bradyrhizobium與豆科植物共生固氮，并能溶解磷酸鹽，產生鐵載體，抑制一些病原體，如鐮刀菌、絲核菌和殼球孢菌[29-30]；Gemmate可促進脲酶的分泌，脲酶可促進酰胺類物質分解，進而提高有機質的利用率[29]。結合以上研究結果推斷，玉米根際和非根際土壤中的Bacillus和Bradyr-hizobium可能參與溶磷和固氮；Streptomyces和Balneimonas可能參與固氮；Pseudomonas、Gemmate和Flavobacterium可能參與有機質的分解和循環。

玉米根際土壤較非根際土壤有較高豐度的可利用養分和細菌多樣性。根際土壤中較高豐度的功能菌屬如Bacillus、Balneimonas、Pseudomonas、Flavobacterium和Streptomyces屬，可能參與土壤中有機質、N和P的循環和利用。玉米根際為功能細菌的生存提供了特定的土壤微生態環境，功能細菌增強了根際土壤養分的循環和玉米的吸收，保障了玉米產量的穩定。