干旱脅迫及復水對 ‘波葉金桂’生理特性的影響

周歡歡，傅盧成，馬 玲，趙亞紅，張汝民，高 巖

（浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

隨著全球二氧化碳濃度上升，溫室效應的出現，生態環境不斷惡化，干旱成為限制植物生長的重要因子［1］。干旱脅迫通過影響葉片光合作用、葉綠素合成和營養代謝等各種生理和生化功能來抑制植物的生長，包括離子的吸收和轉運，呼吸和碳水化合物代謝［2-3］。干旱脅迫導致植物葉片含水量和水勢降低，同時破壞光合膜的結構，阻止各種色素的合成，導致光合作用下降［4］。MANIVANNAN等［5］發現：干旱脅迫導致不同向日葵Helianthus annuus品種的葉綠素a（Chl a），葉綠素b（Chl b）和總葉綠素（Chl t）大幅下降，光合作用降低。活性氧（ROS）是植物代謝過程中的毒副產品，干旱脅迫會導致細胞內ROS大量生成，ROS產生和消除之間的平衡受到干擾。ROS的過量累積會導致細胞水平的氧化損傷，破壞細胞膜，并導致細胞中的酶失活，蛋白質降解和離子失衡［6］。另一方面，植物可以通過復雜的非酶促和酶促抗氧化系統消除細胞內產生的過量ROS，在一定程度上減緩由ROS誘導的細胞穩態的損傷和破壞［7］。例如通過調節超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT），維持體內氧化還原平衡。目前，已有眾多報道，如四季桂Osmanthus fragrans，栓皮櫟Quercus variabilis和狼尾草Pennisetum alopecuroides等保護酶活性和植物體抗旱能力有一定關系［8-10］。同時，干旱脅迫條件下植株通過迅速積累小分子滲透調節物質，如可溶性糖、游離脯氨酸和甜菜堿等，降低細胞水勢，提高細胞的吸水和保水能力，從而維持細胞膨壓，保證植物生理代謝功能的正常進行［11］。陳洪國［12］發現：桂花O.fragrans幼苗的可溶性糖和脯氨酸含量隨土壤含水量的降低而增加，游離脯氨酸通過增加生物聚合體的親水性而提高植物的抗逆境能力，但并未對甜菜堿進行研究。前人研究結果表明：植物自身存在著應對土壤水分變化的生理響應機制，對干旱逆境具有一定的耐性［13］。復水后脅迫解除，植物發生結構及生理方面的適應性改變，迅速彌補由干旱脅迫造成的損傷。研究發現：適宜的干旱不僅不會對作物造成負面的影響，在復水后還會對植物物產生積極的效應，這就是補償效應［14-15］。對不同的高粱Sorghum bicolor品種研究發現：各品種高粱的相對含水量、水勢和光合參數等隨干旱脅迫加重均有所下降，復水后不同品種的補償效果不同［16］。JIN等［17］研究發現，干旱脅迫下馬齒莧Portulaca oleracea的脯氨酸、可溶性糖和保護酶均上升，而復水后上述指標下降，植物恢復正常生長。桂花O.fragrans為木犀科Oleaceae木犀屬Osmanthus植物，在園林和庭院的綠化、美化、香化及裝飾盆景上有特殊地位［18］。以往對桂花的研究主要側重在遺傳多樣性［19］、揮發物成分［20］以及基因表達［21］等方面，關于桂花對干旱環境耐受能力的研究則相對較少。本研究以2年生 ‘波葉金桂’盆栽苗為材料，研究了不同干旱天數及復水對 ‘波葉金桂’O.fragrans‘Boyejingui’葉片中水分含量、滲透調節物質、光合色素以及ROS的傷害和抗氧化酶活性的變化的影響，揭示 ‘波葉金桂’在抗旱防御反應系統中滲透調節物質和抗氧化酶的生理響應調控機制，以及‘波葉金桂’抗干旱的適應能力以及復水后的恢復能力。以期為 ‘波葉金桂’的廣泛栽培，提高其適應性提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2年生 ‘波葉金桂’實生苗，由浙江杭州畫境種業有限公司提供，苗高約50 cm，幼苗于 2017 年 4 月中旬栽植于盛有培養土［m（泥炭）∶m（沙土）∶m（蛭石）=1∶2∶1， 干質量 1.5 kg］花盆中（φ=25 cm，h=30 cm），1株·盆-1。于浙江農林大學大棚內緩苗培育1個月，進行正常栽培管理。實驗期間大棚環境的晝/夜溫度為28℃/20℃，空氣相對濕度為75%，光照條件為自然光。

1.2 試驗處理

2017年5月20日，選取生長良好、無病蟲害且大小相近的 ‘波葉金桂’85盆，隨機分成45盆對照處理，40盆干旱處理。對照組的45盆幼苗隨機分為9組，正常澆水，采用稱重法控制土壤含水量，每天傍晚及時補充水分，土壤含水量保持在20%左右。干旱組隨機分為8組，實行自然干旱處理。5月20日測定1組對照，隨后間隔4 d測定對照、干旱處理各1組，于4 d（5月24日），8 d（5月28日），12 d（6月1日），16 d（6月5日），20 d（6月9日）測定各項指標。測定完后對干旱組剩余3組進行復水處理，復水期間土壤含水量保持在20%左右。間隔2 d測定對照、干旱處理各1組，于22 d（6月11日）， 24 d（6月13日）， 26 d（6月15日）測定各項指標。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤含水量、葉片相對含水量和葉水勢測定 土壤含水量和葉片相對含水量測定采用稱重法［22］；葉水勢測定采用美國WES-COR公司產的PSYPRO露點水勢儀進行。

1.3.2 光合色素的測定 取0.5 g葉片，剪碎后置于帶蓋的試管中，加體積分數為80%的丙酮溶液5 mL，室溫下遮光萃取48 h，至葉片完全變白，將浸提液稀釋10倍，分別測定663，645和470 nm的光密度值（D）。然后根據LICHTENTHALER［23］的公式計算光合色素質量分數。

1.3.3 滲透調節物質質量分數的測定 采用蒽酮比色法［24］測定可溶性糖質量分數；游離脯氨酸質量分數測定采用磺基水楊酸提取茚三酮顯色法［24］；甜菜堿質量分數采用飽和雷氏鹽比色法［25］測定。

1.3.4 ROS和膜質過氧化的測定 傷害率采用電導儀法測定。取 ‘波葉金桂’枝條中上部成熟葉片，放入去離子水中洗凈，用打孔器打孔20個小圓片放入盛有20 mL去離子水的小燒杯中，室溫下放置30 min（每5 min攪拌1次）后測定電導率。然后，加熱煮沸10 min后再次測定電導率。傷害率計算公式：質量摩爾濃度測定參照李忠光等［26］的方法；H2O2質量摩爾濃度測定參照 CHANDRA等［27］的方法；MDA質量摩爾濃度測定參照HODGES等［28］的方法。

1.3.5 抗氧化酶活性的測定 酶液提取方法：將0.5 g冷凍的成熟葉片，液氮磨碎，加入9 mL磷酸緩沖溶液（0.1 mol·L-1，pH 7.4）研磨成勻漿，10 000×g離心15 min（4℃）。取上清液用于SOD，POD和CAT活性的測定。SOD活性測定參照南京建成生物科技有限公司生產的A001-1型SOD試劑盒進行測定和計算。POD和 CAT活性測定參照KUMARI等［29］的方法。

1.4 數據處理

所有數據均為5次重復的平均值±標準差，利用Origin 9.0軟件進行數據處理、圖表制作和統計分析，統計方法采用one-way ANOVA，進行Turkey多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫和復水對土壤含水量、葉片相對含水量和葉水勢的影響

‘波葉金桂’的土壤含水量、葉片相對含水量和葉水勢隨著干旱時間的延長和脅迫程度的加劇呈下降趨勢（圖1）。干旱4 d后，土壤含水量急劇下降，比對照降低了27.1%（P＜0.05）；干旱處理12 d時，葉片相對含水量和葉水勢才開始大幅度下降，分別比對照降低了17.2%和52.6%（P＜0.05）；干旱20 d后，土壤含水量、葉片相對含水量和葉水勢分別比對照降低了56.9%，28.0%和76.9%（P＜0.05）。復水后土壤含水量、葉片相對含水量能快速恢復到對照水平，葉水勢在復水后有個恢復的過程，直到復水6 d后才能完全恢復。此結果也說明了 ‘波葉金桂’有較強的保水能力和抗旱能力。

圖1 干旱脅迫及復水對 ‘波葉金桂’土壤含水量、葉片相對含水量和葉水勢的影響Figure 1 Effects of drought stress and rewatering on soil relative water content，leaf relative water content and leaf water potential ofOsmanthus fragrans ‘Boyejingui’

2.2 干旱脅迫和復水對滲透調節物質質量分數的影響

隨著干旱時間的延長和強度的增加，可溶性糖、游離脯氨酸和甜菜堿質量分數呈上升趨勢（圖2）。干旱12 d時，甜菜堿達到最高，比對照增加了70.4%（P＜0.05）；干旱16 d時，可溶性糖、游離脯氨酸和甜菜堿分別比對照增加了48.7%，2.72倍和53.5%（P＜0.05）。此時可溶性糖質量分數達最大；在干旱20 d時，三者分別比對照增加了38.5%，3.44倍和57.1%（P＜0.05），此時游離脯氨酸質量分數達到最大值。復水4 d后，甜菜堿下降到正常水平，可溶性糖和游離脯氨酸質量分數迅速下降，直到復水6 d后，可溶性糖和游離脯氨酸才恢復到對照水平。干旱條件造成滲透調節物質的積累，說明了滲透調節在植物抵御逆境脅迫中起著重要的作用。

圖2 干旱脅迫及復水對 ‘波葉金桂’滲透調節物質的影響Figure 2 Effects of drought stress and rewatering on osmotic adjustment substances in Osmanthus fragrans ‘Boyejingui’

2.3 干旱脅迫和復水對光合色素的影響

干旱脅迫對 ‘波葉金桂’葉片的光合色素產生了一定的影響。Chl a，Chl b和Chl t隨干旱時間的延長整體呈下降趨勢（表1）。干旱8 d時，Chl a，Chl b和Chl t緩慢上升但與對照差異不大；干旱12 d時，Chl a，Chl b和Chl t開始下降；當干旱20 d時，Chl a，Chl b和Chl t質量分數下降到最低，分別比對照下降了19.0%，16.2%和18.4%（P＜0.05）。復水處理下，Chl a，Chl b和Chl t質量分數持續增加，復水6 d后比對照增加了6.3%，24.3%（P＜0.05）和10.4%。

類胡蘿卜素（Car）質量分數隨干旱時間延長呈顯著上升趨勢（表1）。干旱8 d時顯著高于對照，比對照增加了38.1%（P＜0.05）。干旱20 d時，Car比對照增加了1.05倍（P＜0.05）。復水后Car質量分數降低，干旱6 d后基本恢復到對照水平。

隨著干旱時間的延長，Chl a/b呈先降低后升高的趨勢（表1）。當干旱12 d時，Chl a/b比對照降低了15.5%（P＜0.05），干旱16 d后開始緩慢上升，干旱20 d后基本恢復對照水平。復水后Chl a/b趨向穩定，在3.00左右。

表1 干旱脅迫及復水對 ‘波葉金桂’光合色素的影響Table 1 Effects of drought stress and rewatering on photosynthetic pigment content of Osmanthus fragrans ‘Boyejingui’

2.4 干旱脅迫和復水對ROS和膜質過氧化的影響

隨著干旱時間的延長，O2·-和 H2O2呈逐漸升高的趨勢（表 2）。 干旱 0～8 d時，O2·-和 H2O2各處理間與對照差異不顯著；當干旱12 d時，O2·-和H2O2質量摩爾濃度顯著高于對照，比對照增加了66.2%和28.1%（P＜0.05）；干旱處理16 d時，H2O2質量摩爾濃度達最大，比對照增加了37.6%（P＜0.05）；而干旱處理20 d時，O2·-質量摩爾濃度才達到最高，比對照增加了82.4%（P＜0.05）。

表2 干旱脅迫及復水對 ‘波葉金桂’ROS和膜質過氧化的影響Table 2 Effects of drought stress and rewatering on ROS and membrane peroxidation of Osmanthus fragrans ‘Boyejingui’

ROS的積累造成植物細胞膜脂過氧化，產生MDA從而引起細胞膜的損傷，而傷害率是判定植物細胞膜穩定性的一個重要指標。MDA和傷害率與ROS有類似的變化趨勢。干旱8 d時，MDA質量摩爾濃度迅速提升，比對照增加了35.3%（P＜0.05）；干旱20 d時，MDA質量摩爾濃度和傷害率達最大，分別比對照增加了0.80和2.68倍（P＜0.05）。復水處理后各指標下降，復水6 d后， MDA質量摩爾濃度和傷害率分別比對照增加了35.8%和58.0%（P＜0.05）。這些結果表明：干旱處理使 ‘波葉金桂’葉片膜透性遭到破壞，復水后膜透性仍未完全恢復。干旱處理可對 ‘波葉金桂’造成一定的脅迫。

2.5 干旱脅迫和復水對抗氧化酶活性的影響

植物體內的SOD，POD和CAT主要作用是清除逆境下產生的活性氧，防止膜脂過氧化。隨著干旱時間的增加，3種酶的活性呈先升高后降低的趨勢（圖3）。當干旱4 d時，3種酶活性被顯著激活；當干旱12 d時，SOD活性達到最大，比對照增加了39.7%（P＜0.05），隨后下降；干旱16 d時，而POD和CAT的活性達到最大，分別比對照增加了1.36和0.9倍（P＜0.05），隨后開始下降；干旱20 d時，酶活性下降，但仍顯著高于同期對照。復水2 d后酶活性急劇下降，仍顯著高于對照；復水6 d后酶活性與對照差異不顯著，恢復到對照水平。這些結果說明 ‘波葉金桂’葉片的SOD，POD和CAT在干旱脅迫防御膜脂過氧化過程中起到重要作用。

圖3 干旱脅迫及復水對 ‘波葉金桂’葉片抗氧化酶活性的影響Figure 3 Effects of drought stress and rewatering on antioxidant enzyme activity in leaves of Osmanthus fragrans ‘Boyejingui’

3 討論與結論

在土壤—植物—大氣環流系統（SPAC）中，土壤含水量和葉水勢可作為反映植物水分損失或水分條件的連續體。當土壤水勢降低時，植物迅速降低葉片相對含水量和葉水勢，調節幼苗水勢和土壤水勢梯度，從而增加植物的吸水能力［30］。研究發現：干旱脅迫下枇杷Eriobotrya japonica的土壤含水量與水勢密切相關，植物水勢隨著土壤含水量的降低而降低；西鵑Rhododendron hybridiu和毛鵑Rhododendron pulchrum的土壤含水量和葉片相對含水量與干旱程度呈正相關［31-32］。本研究結果顯示：隨著干旱時間的延長，土壤含水量降低，導致 ‘波葉金桂’幼苗根系吸水困難，葉片相對含水量和葉水勢隨之下降。干旱前8 d， ‘波葉金桂’通過減緩葉片相對含水量下降幅度，提高保水能力，從而保持光合作用系統的完整性，光合色素質量分數高，促使光合作用的正常進行。隨著干旱脅迫程度加深， ‘波葉金桂’葉片相對含水量和葉水勢顯著降低，光合色素合成受到抑制， ‘波葉金桂’生長受到影響。復水后葉片相對含水量和葉水勢隨土壤含水量升高而升高，最后恢復到對照水平，體現了 ‘波葉金桂’較強的細胞持水力及恢復能力。

滲透調節被認為是植物對干旱的重要生理適應方式。植物體內滲透調節物質的積累是植物響應水分虧缺最常見的反應之一［33］。李州等［35］以大葉型和小葉型白三葉Trifolium repens為試驗材料進行脅迫處理發現：干旱脅迫有助于2種白三葉可溶性糖和甜菜堿含量的積累，且滲透調節物質在白三葉響應干旱的過程中占據主要地位；干旱處理下的枸杞Lycium也被發現具有類似規律，可溶性糖與甜菜堿含量呈正相關［36］。本實驗表明：可溶性糖、甜菜堿質量分數隨干旱脅迫強度增加而升高。大量研究表明：可溶性糖和甜菜堿作為滲透調節物質，當植物細胞缺水時，它們可以迅速合成，增加細胞溶質勢，降低細胞水勢，從而吸水能力增加［37］。游離脯氨酸是蛋白質的一種結構成分，迅速生成可調節細胞滲透壓，對能量吸收和還原力、氮儲存化合物、羥自由基清除和保護酶具有保護和穩定功能的作用［38］。有研究認為：干旱脅迫下游離脯氨酸含量積累量與干旱程度呈正相關，小葉蚊母Distylium buxifolium，厚皮香Ternstroemia gymnanthera和輪葉蒲桃Syzygium grijsii等3種樹種的游離脯氨酸隨著干旱脅迫程度的增加快速上升［39］。安玉艷等［40］研究發現：干旱條件下，杠柳Periploca sepium游離脯氨酸的大量積累可能是其在脅迫條件下為生長儲存碳源和氮源或能量的一種方式。本實驗研究表明：游離脯氨酸質量分數在葉片中的積累需要一定的時間。當干旱20 d時，可溶性糖、甜菜堿合成受到抑制，而游離脯氨酸急劇增加，在脅迫下大量積累，其對滲透勢的降低、膨壓的維持貢獻較大。 ‘波葉金桂’通過可溶性糖、甜菜堿和游離脯氨酸的積累來調節滲透勢以提高抗旱能力。復水后，干旱脅迫解除，水勢升高，幼苗體內調節物質逐漸向正常水平逆轉，滲透調節能力逐步下降，可溶性糖、可溶性蛋白質及游離脯氨酸質量分數降低，植株開始正常生長。

葉綠素是光合作用的主要葉綠體成分之一，葉綠素參與光能的吸收、傳遞和轉換等過程，與植物的抗旱性密切相關［41］。關于干旱脅迫下植株葉綠素含量的變化報道不一。李蘭芳等［42］研究發現：干旱脅迫后白刺花Sophora davidii幼苗Chl a，Chl b，Chl t及Car隨著干旱脅迫增強而呈上升趨勢。柴勝豐等［43］認為：金花茶Camellia petelotii葉片Chl t，Chl a，Chl b含量均隨干旱脅迫的增強而下降。本研究中，隨著干旱脅迫的增強， ‘波葉金桂’葉片Chl a，Chl b和Chl t質量分數整體呈下降趨勢，Car質量分數持續上升，Chl a/b呈先下降后上升的趨勢。可能是由于干旱0～8 d時，葉片相對含水量降低導致葉綠素濃縮，葉綠素質量分數稍有上升，該現象是幼苗在干旱脅迫下維持光合速率的生理適應機制［44］。但是植物色素的生物合成過程需要酶的參與，嚴重的干旱脅迫條件降低了葉綠體中一系列合成酶的活性［45］。葉綠素的生物合成減弱，同時植物體自身的活性氧積累，尤其是H2O2能穿透質膜，進入葉綠體中，與葉綠體內自生的H2O2共同引發葉綠體膜脂過氧化，其中間產物自由基和最終產物MDA都會嚴重損傷葉綠體膜結構和功能，進一步導致葉綠素的分解。復水后Chl a，Chl b和Chl t質量分數上升，說明干旱脅迫后復水對葉片Chl a，Chl b和Chl t等均具有一定程度的補償效應。

干旱脅迫導致植物細胞ROS急劇上升，過量的ROS打破了植物體內的氧化還原平衡。ROS的大量積累引起膜脂過氧化加劇，對膜組分和結構造成氧化損傷，產生大量MDA，最終導致膜系統的破壞［46］。胡義等［47］研究發現：重度干旱脅迫（持續干旱10～16 d）下，樟樹Cinnamomum camphora幼樹葉片中的ROS和MDA大量積累；高曉寧等［48］研究發現：杜鵑花Rhododendron在干旱處理下產生過量的活性氧，但MDA變化不顯著。本試驗結果顯示：隨著干旱脅迫的加劇，葉片中O2·-，H2O2和MDA在前16 d顯著上升，說明干旱脅迫造成ROS大量積累，產生了膜脂過氧化作用，對膜造成損害，從而MDA質量摩爾濃度上升，葉片傷害率也隨之增加。因為MDA的積累可引起細胞膜透性增大，大量離子外滲，這是細胞膜受損的表現之一，這也印證了前面的觀點。謝小玉等［49］對辣椒Capsicum annuum的研究得出了相同的結論。植物體內存在抗氧化防御系統，可在一定程度上減緩ROS帶來的傷害。SOD，CAT和POD是植物體內清除ROS的3種重要酶，在抵御干旱脅迫時發揮重要作用。SOD是抗氧化的第一道防線，它催化O2·-歧化生成H2O2和O2，CAT和POD進一步將有毒水平的內源性H2O2轉化為H2O和O2。大量研究表明，植物在遭受干旱脅迫時，清除ROS的酶活性都增加，如四季桂Osmanthus fragrans，栓皮櫟Quercus variabilis等。本研究也發現了類似的規律： ‘波葉金桂’在干旱前16 d，SOD，POD和CAT活性逐漸增強，說明3種酶發揮協同作用，共同清除細胞內ROS。干旱20 d時，從圖3可看出SOD和POD活性仍然較大，繼續保持清除細胞內大量的ROS，是抵御干旱脅迫的主要成員。復水后各指標均能得到恢復，可見 ‘波葉金桂’具有較強的耐旱性。 ‘波葉金桂’在干旱和復水條件下抗氧化酶系統積極發揮作用，清除ROS，使 ‘波葉金桂’能夠在干旱條件下保持較好細胞膜穩定性和較低MDA質量摩爾濃度。

綜上所述， ‘波葉金桂’對于干旱脅迫及復水的響應是由多種內部生理生化反應共同完成的。短期的干旱脅迫下，葉片含水量和水勢降低，ROS積累和膜透性增加， ‘波葉金桂’通過增加滲透調節物質（可溶性糖、甜菜堿和游離脯氨酸）以及抗氧化酶 （SOD，CAT和POD）的活性等減緩ROS給植物帶來的傷害；長期的干旱脅迫下，葉片含水量和水勢的急劇下降，ROS大量累積，抗氧化酶活性下降導致抗氧化系統清除ROS能力下降，光合色素合成受到抑制，而可溶性糖、甜菜堿質量分數和脯氨酸仍然保持高水平，通過滲透調節作用抵抗干旱脅迫，保證苗木代謝正常；脅迫解除后，幼苗表現出較強的旱后修復能力。因此， ‘波葉金桂’在管理養護時，可制定科學合理的水分管理措施，對其進行短期的干旱脅迫（0～8 d），合理利用水資源，最大限度地發揮干旱脅迫的補償效應，當脅迫超過20 d時需及時復水救苗，避免對 ‘波葉金桂’幼苗造成明顯傷害并影響生長。