基于高通量測序的棉花InDel標(biāo)記開發(fā)及其應(yīng)用

陸海燕，陳璐，王顯生，趙涵，沈奇*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；2.鹽城師范學(xué)院，江蘇鹽城224007）

棉花是世界上重要的纖維作物[1]。我國作為主要的棉花生產(chǎn)國家，棉花新品種數(shù)量持續(xù)增加，產(chǎn)量和纖維品質(zhì)也有極大提高，促進(jìn)了棉花生產(chǎn)的發(fā)展[2]。在新品種審定過程中，須通過田間測試評價(jià)品種的特異性、一致性和穩(wěn)定性[3]，工作量大，成本高，且同名異物和近似品種等問題，無形中增加了工作難度。此外，隨著衍生品種的不斷涌現(xiàn)，通過形態(tài)學(xué)鑒定棉花品種顯得越來越難[4]。分子標(biāo)記能有效地在DNA水平上區(qū)分材料之間的差異，反映親緣關(guān)系，可用于輔助選擇近似品種以及棉花品種的鑒定工作。

目前許多分子標(biāo)記已用于棉花品種鑒定等研究中，例如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記[5-8]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）標(biāo)記[9-11]、簡單 重 復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）[12-15]。 盡管這些標(biāo)記能夠在一定程度上揭示不同品種的基因變異，但是部分標(biāo)記仍存在多態(tài)性低、基因型不易判別等局限性。而理想的分子標(biāo)記應(yīng)具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、操作簡便、帶型清晰易判別、在各基因組上分布均勻及開發(fā)使用成本低等特點(diǎn)[16]。

InDel（Insertion-deletion）是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)的堿基序列長度多態(tài)性標(biāo)記[17]。大量研究表明，InDel標(biāo)記不僅具有分布廣、重復(fù)性好、開發(fā)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，而且基因型判別簡單快速[18]。InDel標(biāo)記已經(jīng)被認(rèn)定為1個(gè)重要的分子標(biāo)記來源，并成功應(yīng)用于水稻[19-20]、玉米[21-22]等作物的連鎖圖譜構(gòu)建和品種鑒定。徐鵬等開發(fā)了陸地棉耐鹽相關(guān)的功能InDel標(biāo)記，能夠用于輔助育種改良陸地棉等耐鹽性[23]；Zhang等[24]開發(fā)了一個(gè)能用于區(qū)分?jǐn)y帶核不育修復(fù)基因的恢復(fù)系和不攜帶該基因等位基因的其他基因型的InDel-R標(biāo)記，而InDel標(biāo)記用于解析棉花的遺傳組成差異、棉花品種鑒定和純度檢測等方面的報(bào)道較少。目前，棉花基因組二代測序數(shù)據(jù)提供了豐富的In-Del變異位點(diǎn)，為開發(fā)InDel標(biāo)記提供了便利。通過生物信息學(xué)手段篩選、過濾測序數(shù)據(jù)，評價(jià)多態(tài)性，能夠挖掘有效的InDel分子標(biāo)記。

本研究擬采用來源不同的121份棉花全基因組信息，根據(jù)高多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）篩選多態(tài)性高的InDel位點(diǎn)，基于部分多態(tài)性高的InDel位點(diǎn)，開發(fā)二態(tài)性InDel標(biāo)記，并在66個(gè)棉花主栽品種中進(jìn)行驗(yàn)證；通過基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及對所用棉花品種的背景和來源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)推斷，以獲得可以用于棉花品種鑒定和純度檢測的多態(tài)性In-Del標(biāo)記，提高種子檢驗(yàn)的精確度和效率，并在棉花的育種中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 棉花基因組序列來源及InDel位點(diǎn)的篩選

從 NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）下載 121 份棉花序列，刪除經(jīng)Q20過濾后保留的堿基數(shù)低于棉花理論基因組大小的材料。采用編寫的Perl腳本和VCFtools軟件計(jì)算分析最小等位基因頻率（Minimum average allelic frequency，MAF）和最終保留PIC，選擇MAF大于0.05的位點(diǎn)，刪除基因型缺失率超過20%的位點(diǎn)，同時(shí)以哈迪溫伯格平衡顯著性閥值（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）P＜0.001為標(biāo)準(zhǔn)再次過濾，最終保留PIC＞0.4的二態(tài)性InDel變異位點(diǎn)[21]。

1.2 棉花品種來源

選取來源于我國黃河流域與長江流域棉區(qū)的66個(gè)主栽棉花品種為研究材料，于2018年種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，采集嫩葉提取DNA，用于 PCR 驗(yàn)證（表 1）。

1.3 InDel標(biāo)記開發(fā)和篩選

InDel標(biāo)記開發(fā)：根據(jù)InDel位點(diǎn)和側(cè)翼序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，開發(fā)InDel分子標(biāo)記。每個(gè)標(biāo)記包含上下游（F、R）2條引物，引物設(shè)計(jì)由mInDel軟件包[25]完成，設(shè)置參數(shù)Tm為（58±3）℃，引物長度為（20±3）bp（base paris），PCR 產(chǎn)物預(yù)測長度為100～450 bp，其他參數(shù)為默認(rèn)。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

棉花基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增：取棉花幼嫩葉，按照上海浦迪植物基因組提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA。PCR反應(yīng)總體系為12 μL， 包含上下游引物各 0.5 μL（濃度 為10 μmol·L－1）、6 μL 2 ×TaqMaster Mix、3.2 μL ddH2O、模板 DNA 1.8 μL。PCR反應(yīng)程序：第 1步，94 ℃ 3 min； 第 2 步，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán) ；第 3步：72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在20 g·L－1的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，用凝膠成像儀拍照、記錄。

表1 試驗(yàn)材料詳細(xì)信息Table 1 Details of experimental materials

1.4 多態(tài)性InDel位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分析

凝膠上的帶型讀取方式：短片段讀成A、長片段讀成B、2條帶型讀成H。根據(jù)基因型分型結(jié)果，以及標(biāo)記在棉花基因組染色體上的分布等信息，挑選有效的InDel標(biāo)記。采用編寫的Perl腳本和VCFtools軟件計(jì)算分析二態(tài)性InDel標(biāo)記的MAF、PIC[26]。利用TASSELV5.0軟件的鄰接算法（Neighbor-Joining，N-J）[27]計(jì)算品種之間的遺傳距離并構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花多態(tài)性InDel位點(diǎn)信息分析

通過同源對比過濾121份棉花基因組序列，共篩選出10 967個(gè)二態(tài)性InDel位點(diǎn)（缺失率＜20%，MAF＞0.05）。 物理定位結(jié)果顯示，InDel位點(diǎn)主要分布在基因間區(qū)。

2.2 棉花二態(tài)性InDel標(biāo)記的開發(fā)和鑒定

為了便于電泳技術(shù)檢測目標(biāo)InDel位點(diǎn)差異，選擇生物信息學(xué)分析獲得的大于20 nt的In-Dels，并結(jié)合其在棉花基因組上的位置信息，在這些位點(diǎn)附近選擇合適的位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為InDel標(biāo)記。本研究選取85個(gè)位點(diǎn)合成引物，用于檢測InDel標(biāo)記的多態(tài)性，其中有52對引物是棉花基因組At亞組的特異引物，33對是Dt亞組的特異引物。用85對引物分別擴(kuò)增66個(gè)主栽棉花品種DNA，結(jié)果顯示：64對引物能擴(kuò)增出清晰的帶型（其中部分引物信息見表2），在不同品種之間有明顯的多態(tài)性。以引物JSC009、JSC071為例，在66個(gè)品種DNA中，均能擴(kuò)增出3種帶型：A/B/H（圖1），且產(chǎn)物大小與預(yù)測結(jié)果相吻合。

對擴(kuò)增有效的64對引物位點(diǎn)的多態(tài)性信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果：At亞組染色體的MAF變化范圍為0.15～0.49，平均值為 0.45；Dt亞組染色體的MAF變化范圍為0.14～0.49，平均值為0.32。At亞組染色體的PIC變化范圍為0.16～0.49，平均值為 0.49；Dt亞組染色體的 PIC變化范圍為0.18～0.49，平均值為 0.40（圖 2）。 結(jié)果表明，64對引物具有較高的特異性和穩(wěn)定性。

圖1 高多態(tài)性InDel標(biāo)記JSC009和JSC071對66個(gè)棉花品種DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果Fig.1 The agarose gel electrophoresis results of DNA PCR products with high polymorphism InDel markers JSC009 and JSC071 in 66 cotton cultivars

表2 部分InDel標(biāo)記信息Table 2 The information of partial InDel markers

表2（續(xù)）Table 2（Continued）

圖2 64個(gè)InDel標(biāo)記的遺傳多態(tài)性Fig.2 The genetic polymorphisms of 64 InDels

2.3 InDel分子標(biāo)記在棉花品種鑒定中的應(yīng)用

基于64個(gè)InDel分子標(biāo)記的電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)66個(gè)棉花品種的基因型，計(jì)算其遺傳距離。結(jié)果（表3）表明，所用棉花品種的遺傳距離范圍是0.04～0.65 cM（centimorgan，厘摩），平均為 0.39 cM，表明所用的棉花品種具有豐富的遺傳多樣性，能夠用來驗(yàn)證64個(gè)InDel分子標(biāo)記特異性。遺傳距離最大的2個(gè)品種是泗棉3號（編號為49）和中棉所 36（編號為 43），遺傳距離為 0.65 cM，表明二者的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；遺傳距離最小的是徐棉18（編號為8）和徐雜3號（編號為9），遺傳距離為0.04 cM，表明兩者遺傳差異較小。

66個(gè)棉花品種的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，在Group 1中，來自河南的新植5號、豫雜35、豫雜37、中棉所12、中棉所45聚在一起；鑫秋1號和鑫秋4號聚集，通過對這2個(gè)品種遺傳系譜查詢表明，兩者均來自山東；同樣來自河南的鄭農(nóng)棉4號、鄭育棉2號、鄭雜棉2號聚類在一起。Group 2群體結(jié)構(gòu)顯示，來自徐州的2個(gè)品種，徐棉18和徐雜3號聚類，來自湖南的湘K27、湘XP63、湘K26聚類在一起。在Group 3中，同樣來自河南的銀山2號、豫棉13、中棉所17、中棉所19聚

類在一起。具有相同地理來源的多數(shù)品種聚為一類，但也有例外，如安徽省的2個(gè)品種，綠億棉19劃分在Group 1中，思福棉1號劃分為Group 2；江蘇省的其他7個(gè)品種散落于3組。

表3 遺傳距離統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistics of genetic distance

圖3 基于鄰接算法構(gòu)建的66個(gè)棉花品種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 66 cotton cultivars based on the Neighbor-Joining method

3 討論

在分子水平上揭示不同材料之間的遺傳差異，方法易行，結(jié)果可靠，不受外界環(huán)境條件影響。分子標(biāo)記技術(shù)可在棉花生育早期檢測，準(zhǔn)確鑒定棉花品種間的差異，對于提高種子純度檢測效率有重要意義。Jia等[28]利用80個(gè)全基因組SSR標(biāo)記，對197份亞洲棉進(jìn)行了基因分型，建立了亞洲棉的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)模式。郭旺珍等[5]利用18個(gè)RAPD標(biāo)記，對我國9個(gè)棉花主栽品種的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有13個(gè)標(biāo)記在品種間具有多態(tài)性，證明了RAPD標(biāo)記在品種純度鑒定的可行性；Abdalla等[11]利用16個(gè)AFLP引物組合對我國2種四倍體棉種和3種二倍體棉種進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，AFLP標(biāo)記的多態(tài)性明顯高于RAPD標(biāo)記；匡猛等[1]用36對SSR引物擴(kuò)增32個(gè)材料DNA，共擴(kuò)增出142種基因型，平均每對引物擴(kuò)增出3.94種基因型。本研究用64對InDel引物擴(kuò)增66個(gè)材料的DNA，每對引物均呈現(xiàn)二態(tài)性，提高了基因型判讀的準(zhǔn)確性和效率。

目前，在水稻、人類等物種中，InDel的相關(guān)研究越來越受到關(guān)注[29-30]。InDel標(biāo)記已被公認(rèn)為重要的遺傳標(biāo)記資源，應(yīng)用于高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、全基因組關(guān)聯(lián)分析等研究中。二態(tài)性InDel標(biāo)記具有穩(wěn)定遺傳、多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，通過簡單的PCR及凝膠電泳即可進(jìn)行基因分型。但是二態(tài)性InDel標(biāo)記在檢測多倍體物種中，用一對引物不能實(shí)現(xiàn)該位點(diǎn)多種不同變異的檢測，因此最終產(chǎn)生的二態(tài)性InDel標(biāo)記組合需要覆蓋整個(gè)基因組，才能保證品種鑒定的準(zhǔn)確性。

本研究所用棉花是異源四倍體，基因組的結(jié)構(gòu)變異更為復(fù)雜。棉花二態(tài)性InDel標(biāo)記的獲得對揭示棉花進(jìn)化以及品種鑒定有著巨大的價(jià)值。本研究中，基于棉花基因組序列，采用生物學(xué)手段篩選，挖掘10 967個(gè)InDel位點(diǎn)，這些位點(diǎn)覆蓋棉花基因組的關(guān)鍵區(qū)域。根據(jù)InDel標(biāo)記基因分型特點(diǎn)及位點(diǎn)的多態(tài)性要求，合成85對InDel引物，根據(jù)基因分型結(jié)果，選擇其中高PIC的引物，共64對。通過對66個(gè)棉花材料聚類分析發(fā)現(xiàn)，具有相同地理來源的品種有時(shí)會最先聚為一起，例如徐棉18和徐雜3號，這與Liu等[31]認(rèn)為SSR聚類結(jié)果與地理分布成正相關(guān)基本一致。本研究表明，地理來源相近的多數(shù)品種聚為一類，來自同一種植區(qū)的栽培種親緣關(guān)系較近，遺傳距離和聚類分析結(jié)果基本上反映了品種之間的親緣關(guān)系。棉花At、Dt基因亞組在馴化和選擇過程中的進(jìn)化是獨(dú)立的，各基因組的變異能夠反映整個(gè)棉花的基因組變異。

4 結(jié)論

本研究基于66個(gè)國內(nèi)主要棉花品種，開發(fā)針對棉花At、Dt基因亞組的特異性InDel標(biāo)記，不僅容易檢測，而且能很好地反映棉花之間的差異，有助于棉花品種的檢測以及能夠在棉花分子育種方面提供DNA水平上的信息。