天然彩棉纖維色素形成分子機制研究進展

任慧敏，湯壽伍，宋武，柯麗萍，孫玉強，劉海峰*

（1.中國彩棉（集團）股份有限公司，新疆烏魯木齊830001；2.浙江理工大學生命科學與醫藥學院，浙江杭州310018）

天然彩棉是纖維含有天然色素類物質的特殊類型棉花，它無需化學印染，具有綠色環保的特點，故又稱為“生態棉”。天然彩色棉纖維具有透氣性好，抗靜電，吸汗性強等優點。目前，依據對棉纖維色澤的劃分世界上公認的天然彩色棉花僅有棕色和綠色兩種[1]。根據棉纖維顏色深淺，棕色棉又可分為淡棕色、黃棕色、棕色、灰棕色、深棕色；綠色棉分為綠色短絨、白色纖維和綠色纖維、綠色短絨兩種。

1 天然彩色棉纖維的發育及色素沉積

通過對白色棉纖維發育的研究，發現棉纖維是由胚珠外層珠被上單個表皮細胞分化發育而成，其發育的整個過程可分為四個階段：即纖維發育起始期、伸長期（初生壁增厚期）、次生壁加厚期和脫水成熟期[2-3]，這四個時期是連續、重疊的發育過程，一般經歷45～60 d。彩色棉纖維的發育同樣經歷這4個時期，但在彩色棉纖維發育過程中還伴隨色素物質的合成與沉積，從而使棉纖維呈現出天然色彩[4]。已有研究證明色素的形成與纖維長短、纖維素含量以及纖維品質都具有一定的相關性[5-6]。

有研究者利用黑袋子對開花至吐絮時期的彩棉進行套袋實驗，證實天然彩色棉纖維色素的形成并非是因為纖維吸收了光線中的某些成分，而是由于色素合成相關基因在纖維細胞中特異表達所導致。通過電子顯微鏡對比觀察發現天然彩棉纖維色素的形成起始于初生壁伸長期之后，與次生壁加厚同時進行[7]。王學德等分別提取棕色棉和綠色棉纖維的色素，并根據提取液的吸光值估計色素含量，認為在開花后15 d左右，棕色棉和綠色棉中的色素已形成和沉積，并在開花后20 d色素含量達到最高峰，隨后纖維的顏色逐漸加深[4]。另有研究結果證明棕色棉和綠色棉纖維色素沉積的部位是存在明顯區別的，棕色棉主要沉積在中腔內，而綠色棉在中腔及纖維的次生壁內層也有大量色素沉積[5,7-8]。

2 天然彩色棉纖維色素成分研究

為了進一步研究彩色棉纖維色素形成的分子機制，國內外學者首先對天然彩色棉纖維的色素成分進行分析，但是由于色素提取、分離和純化的方法不同造成即使同一種彩色棉纖維色素所獲得的組成成分也有所不同。

根據已有研究報道棕色棉纖維色素成分主要有以下幾種可能：（1）兒茶素：Ryser等認為棕色棉短絨呈現的棕色是由于單寧的前體兒茶素及單寧的衍生物導致的，同時推測棕色纖維的顏色可能與位于液泡里的由兒茶素衍化的單寧有關[8-9]。（2）黃酮類化合物：研究者利用紫外吸收光譜分析成熟棕色棉纖維的色素提取物，認為棕色棉纖維色素可能是黃酮類化合物[10]。Hua等通過比較白色棉和彩色棉纖維色素合成和沉積的特點，認為黃酮類化合物可能是天然彩色棉纖維色素的主要物質[11-12]。Feng等通過HPLC分析發現柚皮素、槲皮素、山奈酚和楊梅素在棕色棉纖維中的含量顯著高于其在白色棉纖維中的含量，而這四種物質均屬于黃酮類化合物，表明棕色棉纖維色素成分極有可能是黃酮類化合物或其衍生物[13]。（3）醌類化合物：有研究者利用“堿溶酸沉”原理結合乙酸乙酯萃取法純化獲得棕色棉纖維色素，進一步通過化學性質的比較鑒定認為棕色棉纖維色素可能是由單寧氧化形成的醌類化合物[14-16]。（4）原花青素（縮合單寧）：還有部分研究者通過類黃酮結構基因表達分析和DMACA染色實驗表明類黃酮結構基因和原花青素參與了棕色棉纖維色素的形成[17-18]。隨后，有研究團隊比較棕色棉纖維和其近等白色棉纖維的蛋白組學分析發現原花青素是棕色棉纖維色素物質的主要成分[19-20]。進一步對提取、分離的棕色棉纖維色素物質利用NMR和MALDI-TOF MS進行分析鑒定，證實構成棕色棉纖維色素物質原花青素的主要結構單元是表倍兒茶素，同時有少量的表兒茶素結構單元[16]。采用香草醛法測定發現棕色棉纖維和種皮中縮合單寧的平均含量均高于其在白色棉纖維中的含量，而且棕色棉纖維中色素含量越高，棉纖維或種皮中縮合單寧的含量就越高，認為棕色棉纖維色素的合成前體是無色的縮合單寧[15,21-22]。近期有研究證實原花青素含量與纖維色澤有一定關聯[13,16,19]。

綠色棉纖維色素成分的研究相對于棕色棉纖維來說有些少，已有研究表明綠色棉纖維與棕色棉纖維色素的成分是不同的。最早研究結果認為綠色棉纖維色素中含有有機酸，甾醇、香豆素和黃酮類物質[8-9,23]。隨后，有研究者通過脂溶性溶劑對綠色棉纖維色素進行提取，發現提取物中存在苯乙烯酸及其衍生物，并通過相應抑制劑的使用，認為苯乙烯酸及其衍生物是綠色棉纖維產生顏色的重要因素[24-25]。趙向前等發現綠色棉纖維色素除了包含有黃酮類化合物之外，還含有類似蘆丁的黃酮醇化合物[10,26]。張小均等研究發現綠色棉纖維色素主要是脂溶性物質，而棕色棉纖維主要是水溶性物質[27]。近期有研究者從綠色棉纖維中分離出三種化合物，分別是22-O-咖啡?；?22-羥基二十二酸單甘油酯、22-O-咖啡?；?22-羥基二十二酸和二十七酸單甘油酯[28]。

綜上，雖然天然彩色棉纖維色素的具體組分還未明確，但已有研究證實天然彩棉纖維色素成分與植物類黃酮生物合成途徑密切相關，而且近期研究報導再次證明類黃酮生物合成途徑調控棕色棉和綠色棉色素沉積過程[29]。

3 植物類黃酮生物合成途徑

類黃酮化合物是廣泛存在于自然界的一大類次生代謝產物，數量之多被列為酚類化合物之首，多數具有顏色，是植物色素的主要成分。類黃酮化合物顏色一般在淺黃至藍色之間變動，其顏色的顯示與細胞質中的輔助色素、金屬離子和pH值都有很大關系[30]。目前，研究者已經從不同植物中鑒定出超過5000個自然黃酮類化合物。根據其化學結構進行分類，通常分為以下亞組（表 1）：

表1 黃酮類化合物分類Table 1 The classification of flavonoids

植物類黃酮合成途徑是研究最為深入的次生代謝途徑之一，花色素苷的生物合成則是該途徑中研究比較清楚的代謝途徑[31]。植物類黃酮生物合成途徑起始于苯丙氨酸，經苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化形成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸羥化酶（C4H）的催化作用下形成香豆酸，經4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）催化形成香豆酰輔酶A，隨后在查爾酮合成酶（CHS）的催化作用下，香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A反應生成查爾酮，查爾酮（黃色）在查爾酮異構酶（CHI）催化下生成黃烷酮。黃烷酮羥化酶（F3H）催化黃烷酮生成二氫黃酮醇。此后，以二氫黃酮醇為底物存在三條不同的代謝途徑，分別是①二氫黃酮醇在類黃酮3'，5'-羥化酶（F3'5'H）的催化作用下形成二氫楊梅黃酮，進而在二氫黃酮醇（DFR）的作用下生成無色翠雀素；②二氫黃酮醇在類黃酮3'-羥化酶（F3'H）的作用下形成二氫槲皮素，同樣在二氫黃酮醇（DFR）的作用下生成無色矢車菊色素；③二氫黃酮醇直接在二氫黃酮醇（DFR）的催化作用下生成無色天竺葵色素。三種無色花青素進一步在花青素合成酶（ANS）的催化作用下形成相應的有色但不穩定的花青素，隨后，由類黃酮3-糖基轉移酶（3GT）將不穩定花青素轉化為相應的穩定花青素苷，分別是翠雀素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷（磚紅色）和矢車菊色素-3-葡萄糖苷。其中，翠雀素-3-葡萄糖苷和矢車菊色素-3-葡萄糖苷均可以在轉甲基酶的催化作用下最終分別形成藍紫色的錦葵色素（飛燕草色素）和紫紅色的芍藥花色素（矢車菊色素）。此外，無色花色素和不穩定的花青素還可以分別在無色素還原酶（LAR）和花青素還原酶（ANR）的作用下分別還原為兒茶素和表兒茶素，它們進一步反應生成原花青素并最終氧化成縮合單寧[32-33]。

4 天然彩色棉纖維色素相關結構基因的研究

根據已有研究將類黃酮代謝途徑中調控花青素生物合成的基因分為兩類：一類是結構基因，即編碼類黃酮代謝途徑中直接參與花青素苷形成的酶的基因；另一類是調節基因，控制結構基因的表達，從而調節花青素累積的時空模式，如編碼MYB，WD40，bHLH等轉錄因子的基因。

編碼類黃酮代謝途徑相關酶的結構基因目前在天然彩色棉纖維中幾乎都已被克隆鑒定。已有研究者通過同源序列比對等方法從棕色棉纖維中克隆獲得類黃酮合成途徑中的5個關鍵基因 ， 包 括GhDFR，GhCHI，GhF3H，GhANS和GhANR[17]。李艷軍等篩選獲得多個在彩棉中優先表達的cDNA片段，其中包含一個新基因即在類黃酮物質生物合成過程中發揮重要功能的酶基因4-香豆酸-CoA（4CL）[34]。隨后，類黃酮合成途徑中其余關鍵結構基因Gh3GT，GhC4H，GhCHS，GhF3'H，GhF3'5'H在棕色棉中也被成功克隆，其中GhC4H，GhF3'H和GhF3'5'H都屬于細胞色素P450家族[13,35]。

類黃酮生物合成途徑在高等植物中具有很好的保守性。依據植物類黃酮生物合成途徑，將已經在棉花中報道的與纖維色素合成相關的結構基因進行相應介紹。

4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）是類黃酮合成途徑中的關鍵酶。在陸地棉中共發現4個編碼4CL的基因，命名為Gh4CL1-Gh4CL4。在這四個基因中只有Gh4CL2在綠色棉纖維中的表達量顯著高于其在白色棉纖維中的表達，酶動力學分析顯示Gh4CL2對底物咖啡酸酯和阿魏酸鹽都有很強的活性，而已有研究證實咖啡酸酯可能是綠色棉纖維色素的主要成分，說明Gh4CL2和綠色棉纖維色素生物合成具有一定的相關性[28]。

經查爾酮合成酶（CHS）催化形成的查爾酮為其它類黃酮物質的合成提供了基本碳骨架，因此CHS被認為是類黃酮生物合成過程中第一個關鍵限速酶,是花色素體內合成途徑的調節點。GhCHS1在棕色棉纖維中的表達量顯著高于其在近等基因系白色棉中的表達，但是該基因在綠色棉纖維中幾乎檢測不到，推測該基因可能在棕色棉纖維色素形成中發揮重要作用[36]。梁明煒等發現GhCHS在胚珠和纖維中廣泛表達，但在花瓣中幾乎沒有表達，說明棉花纖維發育及其色素形成過程與花色素體內合成途徑密切相關[37]。

查爾酮異構酶CHI是類黃酮生物合成途徑中提高黃酮醇含量的關鍵酶，編碼該酶的基因首次從法國豌豆中分離出來。利用RNAi技術將煙草內源CHI基因的表達量降低，發現煙草花瓣和花粉的顏色都變淺，黃酮含量也發生了相應的變化，說明CHI在植物花色調控等方面發揮重要作用[38]。最新研究發現在棕色棉（ZONG1282）中利用農桿菌介導的RNAi干涉GhCHI的表達，其轉基因后代纖維色澤除了棕色之外，還出現新的顏色：一種接近于白色，另一種是深綠色。這有力證明GhCHI在纖維色澤形成過程中發揮重要作用[29]。

研究發現在矮牽牛和金魚草中將編碼黃烷酮-3-羥化酶（F3H）的基因突變，會使花色素合成通路受阻，導致產生白色的矮牽牛和金魚草[39-40]。Tan等人通過雜交將GhF3H基因RNAi片段導入棕色棉（T586）背景中,發現含有GhF3H-RNAi片段的棕色棉植株其花瓣顏色變淺，纖維顏色變深，與預期相反，由此推測可能F3H上游類黃酮物質也是產生棕色棉纖維的因素之一[41]。

黃烷酮 3'，5'-羥化酶（F3'5'H）屬于細胞色素P450酶家族中CYP75家族，是產生藍色的飛燕草色素的一個關鍵酶。引入外源F3'5'H基因來改變植物花色在多種植物中已獲得成功[42]。 已有研究發現，GhF3'5'H主要在纖維發育早期高表達，其在棕色棉纖維和綠色棉纖維中的轉錄表達水平明顯高于其在白色棉纖維中的表達，推測其可能參與彩色棉纖維色素前體物質的合成[43]。

二氫黃酮醇還原酶（DFR）是位于花青素和原花青素合成途徑后期的一個關鍵酶。利用VIGS技術將GhDFR1基因沉默發現顯著降低了花青素和原花青素的積累量，而且相對于對照植株，在GhDFR1基因沉默的棉纖維中兩種縮合單寧單體（表兒茶素和表沒食子兒茶素）的含量嚴重減少，但同時卻檢測到兒茶素和沒食子兒茶素。進一步將GhDFR1轉入擬南芥tt3突變體發現轉基因陽性植株種皮能夠積累縮合單寧，綜合以上結果證明GhDFR1在棉花花青素和原花青素的合成過程中發揮重要功能[44]。

花色素還原酶（ANR）能夠將植物中的花色素轉化為相應的表兒茶素類物質，這類物質既是原花青素合成的構成單位，也是原花青素聚合的起始單位。研究發現利用病毒介導的基因沉默技術將GhANR1的表達量降低導致在棉花葉片和莖中積累大量的花青素，而原花青素含量明顯減少，說明ANR在原花青素生物合成過程中發揮一定功能[45]。

除以上研究，該途徑中編碼其它酶的基因，包括PAL，C4H，CHI，LAR，ANS，3GT在棕色纖維中表達量顯著高于其在白色棉纖維中的表達[16,18,20]。綜合現有天然彩棉中對類黃酮生物合成途徑結構基因的研究發現，結構基因轉錄水平的表達變化與天然彩色棉纖維色素的含量具有相關性，從而影響棉纖維色澤的呈現。

5 天然彩棉中類黃酮代謝途徑結構基因的轉錄調控研究

類黃酮合成途徑中的結構基因大多通過協同作用發揮功能，而這些結構基因的協同表達可能受一些調節基因的調控，不同調節基因之間通過相互協調決定結構基因的時空表達模式，從而調控植物色澤。目前發現的調節基因主要是編碼轉錄因子家族的基因，已發現的轉錄因子包括R2R3-type MYB,WD40,bHLH,WRKY,Zinc finger和 MADS box，其中以 MYB-bHLH-WD40三聯體（MBW）調控類黃酮合成途徑的研究相對深入。已有報導發現在模式植物擬南芥中多個MBW復合體參與類黃酮結構基因的表達調控，如AtDFR，AtANS，AtANR等[46-49]。

MYB轉錄因子在植物次生代謝、信號傳導、生長發育及植物抗逆等過程中發揮著重要的調控作用，其中R2R3-MYBs轉錄因子在次生代謝途徑中對類黃酮生物合成所需酶類發揮正調控或負調控作用。近年有文獻報道編碼轉錄因子GhTT2_A07的基因在棕色棉纖維發育過程中其轉錄水平表達明顯上調，與PA積累和色素形成具有很大相關性[50]。研究者從陸地棉中分離獲得TT2-型的MYB轉錄因子GhMYB36和Gh-MYB10，發現GhMYB36和GhMYB10作為MBW復合體的組成部分能夠激活棉花中LAR和ANR的啟動子，同時GhMYB36和GhMYB10都能夠互補擬南芥tt2突變體的功能，說明Gh-MYB36和GhMYB10在原花青素合成途徑中發揮重要功能[51]。最新研究發現棕色棉中與TT2同源的GhTT2-3A激活GhbHLH130D，并與GhTT2-3A協同作用促進下游PA結構基因的表達從而調控PA的生物合成和積累，導致棕色棉纖維色澤改變[52]。MYB轉錄因子除了以MBW三聯體發揮功能外，部分MYB轉錄因子可以單獨調控類黃酮生物合成，如擬南芥MYB12可以單獨激活類黃酮生物合成過程中CHS/CHI/F3H/FLS1四個結構基因的轉錄，使其協同表達[53]。此外，將擬南芥MYB轉錄因子PAP1進行異位表達導致植物多數器官呈現深紫色[54]。這些都為彩棉纖維色澤改良提供了新的研究方向和參考依據。

在植物中，bHLH類轉錄因子在花器官發育、光形態建成、表皮細胞分化和類黃酮生物合成途徑等過程中都發揮功能。在類黃酮生物合成途徑中bHLH通常與MYB轉錄因子共同作用才能發揮其功能[55]。玉米中的R基因和B基因是植物中分離得到的第一個編碼參與類黃酮途徑的bHLH轉錄因子[56]。bHLH類轉錄因子可以調節類黃酮生物合成途徑的一條或多條分支，如玉米中ZmR參與花青素合成途徑[56]，在擬南芥中TT8能調控花青素和原花青素兩條途徑[55]。目前，通過同源進化分析已經在不同棉花品種中鑒定發現多個屬于bHLH類轉錄因子家族的基因，但這些基因是否在類黃酮生物合成途徑中發揮調控功能還有待進一步詳細研究[57]。

WD40（WDR）蛋白是細胞分化、信號轉導和囊泡形成以及轉運過程中的關鍵調節因子，該蛋白可以通過調節類黃酮途徑控制植物的其它生理發育過程[58]。在 MYB-bHLH-WD40三聯體（MBW）中，WD40和MYB以及bHLH成員不一樣，它不具有酶活性，無法直接識別靶基因的啟動子序列，而主要是通過增強三聯復合體的激活作用來發揮其功能[59]。植物中最早報道參與花青素合成過程的WD40轉錄因子是矮牽牛中的AN11[60]，而擬南芥TTG1是最先發現的以MBW復合體形式參與調控作用的WD40蛋白[61]。在棉花中分離鑒定獲得與擬南芥TTG1同源的GhTTG1和GhTTG3，利用紫羅蘭ttg1突變體對GhTTG1和GhTTG3的生理功能進行分析發現，表達GhTTG1和GhTTG3的花瓣由純白色變為帶紫色斑點的花瓣，說明GhTTG1和GhTTG3在花青素調控的色素形成過程中發揮重要功能[62]。

轉錄因子是非常龐大的基因家族，具有很強的調控功能。單個或多個轉錄因子能夠協調控制結構基因的時空表達，從而影響植物色素的累積。但目前這部分的研究極為有限，結合其它植物中轉錄因子的研究方法及功能報道，通過同源進化比對，在彩棉中挖掘具有類似功能的候選調節因子，檢測其對彩色棉纖維中高表達的結構基因的調控作用，以期獲得能夠改變纖維色澤的轉錄調控候選因子。

6 展望

天然彩色棉是無污染的綠色生態棉，它符合人們追求綠色環保的要求，但由于其色澤較為單一，因此，深入研究彩色棉纖維色素形成過程及其分子機制是研究者一直關注的熱點，同時也是進行彩棉育種和改良的關鍵?；ㄇ嗨睾驮ㄇ嗨睾铣赏緩绞侵参镏杏嘘P色素合成研究較為清楚的次生代謝途徑。綜合現有研究報導發現彩色棉纖維色素的形成與該次生代謝途徑具有很大相關性，但已有研究多數集中在結構基因轉錄水平的表達變化，而對于基因本身功能的研究還相對較少，尤其是對于轉錄調節因子的研究?；谵D錄因子的高度保守性，可以借鑒其他植物中已有研究結果，對結構基因和轉錄調控因子進行深入的功能研究。同時可以通過蛋白組學、代謝組學等方法輔助分析獲得可能的候選基因，這些都將為彩棉育種提供理論依據；而且可以高效結合基因工程技術在彩棉中進行改良，為彩棉育種開辟新的路徑。