短乳桿菌和植物乳桿菌產γ-氨基丁酸及其關鍵基因的研究

韓嘯，于雷雷，翟齊嘯，崔樹茂，趙建新，張灝，田豐偉，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質[1]。研究表明，GABA具有降血壓[2]、抗焦慮[3]、保護腎臟[4]、促進生長激素分泌[5]、增強免疫力[6]等生理功能。作為一種新型功能因子，GABA現已逐步應用于食品、醫藥、養殖等行業中。

GABA廣泛分布于動物、植物和細菌中，而乳桿菌被認為是細菌中GABA的重要生產者。已報道常見的具有產GABA能力的乳桿菌包括短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)[7-9]、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)[10-12]、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)[13-14]、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)[15]等。乳桿菌中GABA是由L-谷氨酸或其衍生物在谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)作用下經過不可逆脫羧而成的，和菌體自身耐酸機制有關。當受到環境的酸脅迫時，乳桿菌細胞質中的GAD消耗細胞內的H+，催化L-谷氨酸脫羧生成GABA，而位于細胞膜上的Glu/GABA反向轉運蛋白則將細胞內的反應產物GABA交換到細胞外，同時將細胞外的L-谷氨酸運輸到細胞內。在此過程中，乳桿菌細胞內的pH維持了穩態，從而使菌體在酸性環境中得以存活[16]。

人們觀察到，不同種屬乳桿菌產GABA的能力不同，同種屬間的產GABA能力也有差異[15]。影響GABA產量最常見和最重要的因素是pH、溫度、培養時間和培養基添加劑等。所以，現有研究大都集中在尋找最佳培養基和培養條件，以獲得更高的GABA產量[17]，但是對于乳桿菌產GABA的情況以及相關基因表達規律缺少系統性研究。本研究選取了8個種屬68株的乳桿菌，在NCBI-GenBank數據庫中對這幾個種屬進行基因組學調查，利用高效液相色譜法(high efficiency liquid chromatography，HPLC)比較了不同種屬間產GABA能力的差異，并研究了上述乳桿菌GAD相關基因在基因水平、轉錄水平的差異，以期為后續產GABA菌株的篩選，GAD基因的表達調控，GABA發酵工藝的優化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

由發酵食品與健康人群新鮮糞便篩選得到8個種屬68株乳桿菌(表2)，均來自于江南大學食品學院生物技術菌種保藏中心。

1.2 培養基

MRS液體培養基，用于乳桿菌的活化；MMRS發酵培養基，用于產GABA乳桿菌的篩選。

MRS培養基成分(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏 10，酵母粉 5，葡萄糖 20，無水乙酸鈉 2，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.25，檸檬酸氫二銨 2，K2HPO4·3H2O 2.6，Tween 80 1，pH值6.2～6.4。

MMRS培養基成分(g/L)：在MRS培養基的基礎上添加1.5%的L-谷氨酸鈉作為GABA合成的前體物質。

1.3 材料與試劑

GABA標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-谷氨酸鈉(L-MSG)，國藥集團化學試劑公司；TRIzol試劑，Qiagen公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；2×TaqMasterMix(Dye)，康為世紀生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT試劑盒，寶日醫生物技術(北京)有限公司(Takara中國)；其他試劑為市售分析純。引物合成，上海生工生物工程有限公司。

1.4 儀器與設備

高效液相色譜，美國Thermo公司；超凈工作臺ZHJH-C1115B，上海智誠分析儀器制造有限公司；電子天平，精密pH計FE-20，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋MLS-3750，日本Sanyo公司； T100PCR儀，核酸電泳儀，凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；CFXConnect Real-time System，美國Bio-Rad公司；冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；Milli-Q Reference超純水系統，德國Millipore公司。

1.5 方法

1.5.1 產GABA乳桿菌的篩選

1.5.1.1 菌株培養條件

將實驗室保藏的乳桿菌菌株進行活化，用接種環蘸取保菌管中少量菌液在MRS固體培養基上劃線，平板置于37 ℃培養48 h。挑取單菌落接入5 mL的MRS液體培養基中于37 ℃培養18 h。以2%的接種量接入到10 mL的MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h作為后續培養的種子液。取2%的種子液接種到添加了1.5%MSG的MMRS培養基中37 ℃培養48 h。

1.5.1.2 樣品預處理

取不同發酵時間(6、12、24、48 h)的樣品1 mL，經8 000 r/min離心5 min，將上清液稀釋一定倍數，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即可用于衍生反應。

1.5.1.3 發酵液中GABA含量的測定

本研究使用HPLC測定發酵上清液中的GABA的含量。分析條件按照國標QBT 4587—2013修改而成。色譜條件為：色譜柱Hypersil GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm)；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；流動相A為20 mmol/L醋酸鈉水溶液，流動相B為V(40 mmol/L醋酸鈉水溶液)∶V(乙腈)=1∶1；流速0.2 mL/min；檢測波長338 nm。洗脫梯度為0～6 min，B由30%升至50%；6～11 min，B由50%升至60%；11～12 min，B由60%升至100%并保持3 min；15～16 min，B由100%降至30%；16～20 min，30% B保持4 min。

樣品衍生：

(1)0.4 mol/L硼酸緩沖液的制備：準確稱取2.47 g硼酸，加水約80 mL，用NaOH將pH調至10.2，用水定容至100 mL。

(2)衍生試劑的制備：稱取0.1 g鄰苯二甲醛(OPA)，用1 mL乙腈溶解，然后加入130 μL巰基乙醇，用水定容至100 mL。

(3)樣品柱前衍生：吸取衍生試劑10 μL，預處理后樣品10 μL，混合均勻后在室溫下反應90 s后進樣。

標準曲線的配置：精確配制質量濃度為0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 g/L的GABA標準樣品，分別衍生進樣后，以GABA的色譜峰面積為縱坐標，相應的質量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。

1.5.2 GAD相關基因序列擴增

菌體總DNA的提取采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書操作。使用軟件Primer 5.0分別對GAD相關基因進行引物設計。本文所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

PCR反應體系： 2×TaqMasterMix 12.5 μL，DNA模板 1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性 30 s, 57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共30個循環; 72 ℃退火5 min。

1.5.3 GAD相關基因轉錄分析

1.5.3.1 乳桿菌RNA提取

菌株的培養同1.5.1.1分別取6，12，24和48 h的發酵液，于8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取適量菌泥于滅酶后的研缽中，倒入適量液氮進行研磨，重復研磨3次，將粉末收集于無酶1.5 mL離心管中，加入1 mL TRIzol，混勻，置于4 ℃冰盒，以下操作均在4 ℃下完成。每個離心管加入1/5體積的三氯甲烷(提前4 ℃預冷)，即200 μL，手搖振蕩后，靜置5 min，分層，12 000×g4 ℃離心15 min，用槍頭吸取最上層300 μL至新的無酶1.5 mL離心管中。加入300 μL等體積的異丙醇(提前4 ℃預冷)，靜置10 min，于12 000×g4 ℃離心15 min，棄上清，可適當留底。加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配制，提前4 ℃預冷)于12 000×g4 ℃離心7 min，棄上清，可適當留底，重復1次，自然放置晾干，加入20 μL DEPC水，輕彈，混勻。取1 μL，測RNA濃度。

1.5.3.2 RNA的反轉錄

使用PrimeScriptTMRT試劑盒進行反轉錄，qRT-PCR所用引物見表1，其中16S rRNA基因作為內參基因。

RT-PCR體系為20 μL體系：1 μL模板；2 μL mix；17 μL無酶ddH2O。反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、10 min。qPCR反應條件:95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，39個循環。

2 結果

2.1 不同乳桿菌產GABA能力研究

本文利用HPLC研究了由發酵食品與健康人群新鮮糞便篩選得到的8個種屬68株乳桿菌，具有產GABA能力。從表2和圖1可以看出，產GABA的菌株主要集中在L.brevis、L.plantarum這2個種屬上，其中L.brevis發酵上清液的GABA含量可達5 000 mg/L左右，L.plantarum發酵上清液的GABA含量可達400 mg/L左右。而其余種屬的菌株的發酵上清液并沒有檢測到GABA的存在。結果表明乳桿菌產GABA的能力具有種屬特異性。同時，同一種屬中有的菌株產GABA的能力高，而有的菌卻基本不利用MSG產GABA。以L.brevis為例，L.brevisHY2-1、DL1-11、RS6-12均能產生較高水平的GABA，其中L.brevisDL1-11產量最高，為5 072 mg/L。但與此同時，L.brevisWX7-1、WX7-3、WX17-3的GABA的含量卻很低。因此，我們認為同一種屬的不同菌株產GABA能力也是不同的，具有種內特異性(表2)。

表2 不同乳桿菌產GABA能力Table 2 Production of GABA by different lactobacilli

圖1 不同植物乳桿菌和短乳桿菌產GABA能力圖Fig.1 Different L. plantarum and L. brevis produce GABA ability

2.2 乳桿菌GAD相關基因的基因組學調查

目前，已經報道了微生物中GABA產生主要是通過腐胺的降解(Puu和ADC途徑)或谷氨酸的脫羧(GAD途徑)這2種途徑。然而，由于缺乏Puu和ADC途徑，由腐胺降解產生的GABA在乳桿菌中并不常見[19]。gad操縱子主要由編碼轉錄調節因子(gadR)、谷氨酸脫羧酶(gadA或gadB)和Glu/GABA反向轉運蛋白(gadC)的基因組成。目前，已有超過1 000種乳酸菌已經測序并保藏在NCBI-GenBank數據庫中。因此，對本研究所用的8種乳桿菌進行了基因組調查，以檢測是否存在gad操縱子和編碼谷氨酸脫羧酶的基因，結果如表3所示。

從表3可以看出，許多菌株攜帶gadA或gadB，但是gadR、gadC僅存在于有限種屬的基因組中，表明它們具有種屬特異性。其中，L.brevis與其他種類的乳桿菌有明顯的不同：(1)具有完整的gad操縱子，(2)其基因組中有2個編碼谷氨酸脫羧酶的基因(gadA和gadB)。雖然大多數L.plantarum擁有gadB基因，但在我們調查的菌株中都沒有gadC。YUNES等[19]在L.plantarum90sk的基因組發現了一種蛋白質，其與L.brevis15f的gadC的氨基酸序列具有25%的同源性。該蛋白質在Inter-ProScan中注釋為氨基酸跨膜轉運蛋白，他們認為這種蛋白質在L.plantarum90sk中可能發揮類似于Glu/GABA逆向轉運蛋白的功能。盡管本研究中所用的L.reuteri均不能產GABA，但基因組學調查結果顯示很多L.reuteri也含有gadB和gadC。有趣的是，SU等[20]通過基因組分析發現L.reuteri100-23 谷氨酸代謝的基因簇中含有2個Glu/GABA反向轉運蛋白(gadC1和gadC2)，還含有編碼的谷氨酰胺酶亞型3的基因gls3。因為谷氨酰胺可在谷氨酰胺酶的作用下生成谷氨酸，所以L.reuteri100-23中這種特殊的谷氨酰胺脫酰胺和谷氨酸脫羧耦聯形式更有助于菌體耐受酸脅迫，也具有高產GABA的潛力。此外，L.fermentum、L.reuteri在基因水平上顯示其也有產GABA的潛力。對于L.paracasei、L.helveticus等種屬來說，大多數菌株不含有gadB基因，這可能是本研究中上述種屬的菌株不產GABA的根本原因。

表3 不同乳桿菌GAD基因分布情況Table 3 Distribution of gad operon and genes encoding glutamate decarboxylases in the sequenced

注：基因組調查日期截止于2019年1月1日。

我們在上述擁有gadA或gadB基因的種屬中各選取1株，作出其GAD系統相關基因分布圖如圖2-A所示，L.brevisgad操縱子同源性分析如圖2-B所示。

圖2 乳桿菌GAD基因相對位置和短乳桿菌gad操縱子同源性分析圖(A)和乳桿菌GAD基因相對位置(B)短乳桿菌gad操縱子氨基酸序列的系統進化樹Fig.2 Common distribution and arrangement of gad operon in Lactobacillus strains and Homology analysis of L.brevis GAD operon (A) Distribution of gad operon in Lactobacillus strains and (B)Phylogeny of amino acids sequences of four components in gad operon of L.brevis

可以看出，L.brevis基因組中gadR和gadC彼此接近可確保其及時共同調節gadB的轉錄和翻譯以用于GABA生產，gadA基因位置與gadB位置較遠且同源性不高，說明可能gadA與gadB的基因調控方式不同。但是gadA和gadB的共同存在可能是L.brevis高GABA合成能力的原因。

2.3 乳桿菌GAD相關基因序列擴增

為了研究本文所用乳桿菌是否擁有GAD相關基因，我們根據文獻中或GenBank上不同種屬已測序菌株GAD相關基因的保守區域，利用軟件Primer 5.0設計種屬特異性引物進行驗證，結果如圖3。

凝膠電泳結果顯示，6株L.brevis均具有完整的GAD操縱子，在14株L.plantarum中也檢測到8株擁有gadB基因，HPLC結果也表明6株沒有gadB基因的菌株沒有 GABA產生。而10株L.fermentum中有7株基因組中有gadC、gadB，但其發酵上清液中卻沒有檢測到GABA。YUNES等[21]研究了21株L.fermentum產GABA能力和gadB的分布情況，發現其中只有9株含有gadB基因且所有L.fermentum均不能利用MSG產GABA。他認為這可能是由于L.fermentum中gadB、gadC基因的突變或并未表達引起的。除了上述3種乳桿菌，其余5個種屬的乳桿菌我們均未檢測到gadB的存在。盡管有研究成功克隆了L.paracasei、L.sakei的gadB基因[22-23]，但綜合本研究的GABA產量、基因組學調查和gadB的基因的擴增結果來看，大多數L.paracasei、L.helveticus、L.casei和L.sakei是不含有gadB基因或者不具有產GABA能力的。

圖3 (A)乳桿菌GAD基因凝膠電泳結果、(B)短乳桿菌、(C)發酵乳桿菌和(D)植物乳桿菌Fig.3 PCR result of gad operon in (A)Lactobacillus strains，(B) L.brevis，(C) L. fermentum and(D) L. plantarum

2.4 L. brevis和L. plantarum GAD相關基因轉錄分析

為了研究L.brevis和L.plantarum中GAD相關基因轉錄水平的變化規律以及轉錄水平和GABA產量之間的關系，我們將可以產生GABA的菌株分別發酵6、12、24、48h并利用qRT-PCR進行相對定量，結果如圖4。

圖4 短乳桿菌不同生長時期GAD基因相對表達量變化(A)gadR、(B)gadC、(C)gadB和(D)gadAFig.4 Relative gene expression of of gad operon in L.brevis at different growth stages (A) gadR，(B)gadC，(C) gadB and (D) gadA

由于乳桿菌在生長過程中會產生乳酸等有機酸，菌體生長進入穩定期前，培養液的pH值下降很快[18]。而GAD系統是細菌對抗酸性環境的耐酸系統之一，可以維持自身代謝和細胞活力[24]。所以，L.brevis的gadB和gadC的表達量變化與菌體的生長時期相一致。隨著菌體進入對數后期或穩定期，L.brevis為了耐受酸脅迫，gadB和gadC的表達量大幅增加。LI等[8]研究L.brevisNCL912在分批補料發酵過程中gadC和gadB基因表達規律時也發現了類似現象。從圖4可以看出，L.brevis的gadC和gadB的相對表達量變化趨勢相似，說明可能有gadC和gadB的共轉錄產物gadCB的存在。彭春龍等[18]設計了引物gad-P1和gad-P2，其中上游引物gad-P1位于gadC內并臨近其3’端，下游引物gad-P2位于gadB內并臨近其5’端，以菌體所提取mRNA的反轉錄cDNA為模板，對目的片段進行擴增，排除了基因組DNA污染的可能后，得到了約550 bp的目的片段，證明了gadCB的存在。在菌體不同生長時期，gadA的表達量始終處于一個平穩的狀態，說明gadA可能與L.brevis耐酸系統無關。和6 h相比，6株L.brevis的gadR和gadA的變化量都很低，而gadC和gadB在12和24 h表達量迅速增加。短乳桿菌不同生長時期發酵液中GABA積累量變化如圖5所示，可以看出在gadC和gadB高表達的期間，發酵液中GABA迅速積累，而在24～48 h，積累速度有所減緩，發酵液中GABA的積累速度與gadC和gadB表達量變化呈現一定的相關性，說明gadC和gadB為L.brevis產GABA的關鍵基因。

圖5 短乳桿菌不同生長時期發酵液中GABA積累量變化Fig.5 Changes of GABA accumulation in fermentation broth of L. brevis at different growth stages

本文以L.brevisWX7-1為對照，發現GABA產量較高的3株L.brevis的gadC和gadB的表達量顯著地超過了低產的菌株(圖6)，說明L.brevisWX7-1、WX7-3、WX17-3這3株菌雖然擁有gadC和gadB基因，但其幾乎不表達或表達量少，直接導致了低水平的GABA產量。值得注意的是，最高基因表達量的L.brevisRS6-12的GABA產量卻沒有L.brevisDL1-11的高，這可能是由于GAD酶活不同導致的，需要進一步研究。

圖6 不同短乳桿菌GAD基因相對表達量比較(A)gadC和(B)gadBFig.6 Relative expression of GAD gene in different L. brevis strains (A) gadC and (B) gadB

L.plantarum菌體不同生長時期gadB相對表達量的結果和L.brevis類似，菌體由延滯期進入對數期，gadB表達量不斷增高，在穩定期達到了高峰，進入穩定期后期，表達量開始下降(圖7-A)。但以L.plantarumDL3-1為對照，gadB表達量高的菌株，GABA產量卻不一定高，例如L.plantarumHY8-2的gadB表達量在4個時間點相對表達量都比較高，但是GABA的最終積累量卻處于一個較低水平，說明本研究中的L.plantarumGABA產量和gadB的表達量之間的關聯性沒有那么密切，可能是因為除了基因表達量，L.plantarum的GABA產量還和其他一些因素有關，例如酶活性、PLP濃度和pH等[25]。

圖7 植物乳桿菌gadB相對表達量(A)菌體不同生長時期相對表達量變化和(B)不同植物乳桿菌GAD基因相對表達量比較Fig.7 Relative expression of gadB gene in L. plantarum (A) relative expression in different growth stages of L. plantarum and (B) comparison of relative expression of GAD gene in different L. plantarum strains

3 結論

根據本研究的GABA產量、基因組學調查和gadB的基因的擴增結果來看，可得到以下結論：(1)L.brevis、L.plantarum可作為產GABA菌株的主要篩選對象。(2)L.fermentum和L.reuteri的部分菌株在基因水平也有產GABA的潛力。(3)大多數L.paracasei、L.helveticus、L.casei和L.sakei不含有gadB基因或者不具有產GABA能力。L.brevis和L.plantarumGAD相關基因轉錄結果表明：(1)L.brevis的gadB和gadC的表達量變化與菌體的生長時期相一致，在對數后期或穩定前期達到高峰，且本研究的L.brevis高產GABA可能與gadC和gadB的高表達有關。(2)L.plantarum的gadB的表達量也在對數后期或穩定前期達到高峰，但是GABA的產量和gadB的表達量之間相關性不強，可能受其他因素影響，有待進一步研究。