丙酮酸羧化酶對釀酒酵母積累琥珀酸的作用探究

陳園園，程慧，李寧娜，蘇珂，李佳雨，夏華龍，徐國強*,張梁*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫,214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

琥珀酸是一種二元羧酸，作為眾多化工產品的合成前體，廣泛應用于醫藥、農藥、染料、香料、油漆、食品、塑料等行業[1]。研究發現，琥珀酸能夠促進脂肪燃燒，這將為解決肥胖癥提供新的研究思路[2]。目前琥珀酸的工業化生產主要依賴于化學合成法[3-4]，而化學合成法生產的琥珀酸難以達到食用要求。為解決這一難題，越來越多的研究者致力于微生物發酵法生產琥珀酸[5-8]。釀酒酵母因其安全、無毒素分泌已經被廣泛應用于食品發酵工業。同時釀酒酵母具備耐高滲[9]、耐低pH[10]的優點，因此更多的研究者致力于通過代謝工程手段促進釀酒酵母積累琥珀酸。但目前存在以下問題尚須解決[11]：(1)高效的琥珀酸合成途徑的構建；(2)進入三羧環循環(tricarboxylic acid, TCA)的碳流量的加強。

菌體內的琥珀酸作為TCA循環的中間產物,在琥珀酸脫氫酶作用下轉化為富馬酸，而琥珀酸脫氫酶由基因SDH1、SDH2、SDH3和SDH4編碼[12]。因此，弱化琥珀酸脫氫酶成為構建琥珀酸積累途徑的首要條件。如OTERO等[13]敲除琥珀酸脫氫酶基因SDH3、3-磷酸甘油酸脫氫酶同工酶基因SER3和SER33,成功利用乙醛酸支路積累琥珀酸；RAAB等[14]則敲除基因SDH1、SDH2和異檸檬酸脫氫酶基因IDH1、IDP1,同時利用TCA還原途徑和乙醛酸支路實現琥珀酸積累。丙酮酸羧化酶(pyruvate acid，PC)作為菌體內草酰乙酸回補途徑關鍵酶，成為增強TCA循環碳流量的關鍵。如YAN等[15]過量表達釀酒酵母本身的丙酮酸羧化酶基因PYC2，促進了琥珀酸的積累。本課題組前期在探究代謝工程手段改造釀酒酵母積累富馬酸時發現，來源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因(RoPYC)較釀酒酵母本身的PYC2更能促進富馬酸的積累[16]。

本實驗以釀酒酵母為研究對象，敲除對琥珀酸脫氫酶酶活影響最大的基因SDH2,使琥珀酸通過TCA氧化途徑得到積累。在此基礎上考察了來源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因RoPYC的表達對琥珀酸積累的影響,進而考察了微量元素Ca2+和生物素對PC酶表達及琥珀酸積累的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒、及引物

S.cerevisiaeCEN.PK 2-1C，由本實驗室于-80 ℃保藏；敲除型質粒pUG72和Cre蛋白分泌質粒pSH63，由本實驗室保藏；基因敲除時所用引物，由金唯智生物技術有限公司合成(表1)。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 酶和試劑

質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性內切酶、T4 DNA連接酶，均來自上海皓嘉生物技術有限公司；生物素，上海生物工程股份有限公司；琥珀酸脫氫酶酶活測定試劑盒、丙酮酸羧化酶酶活測定試劑盒，蘇州科銘生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：酵母粉5，NaCl 10，蛋白胨 10。YPD培養基(g/L)：Peptone 20，酵母浸膏10，葡萄糖20，固體培養基加瓊脂粉20。YPG培養基(g/L)：Peptone 20，酵母浸膏10，半乳糖20，固體培養基加瓊脂粉20。SD-Leu種子培養基：葡萄糖20 g/L，YNB 1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，10×AA 100 mL，100×His、100×Ura、100×Arg、100×Trp各10 mL。SD種子培養基：在SD-Leu培養基的基礎上添加100×Leu 10 mL/L。SD-Leu發酵培養基(g/L):葡萄糖 40，KH2PO43，K2SO46.6，MgSO4·7H2O 0.5，尿素 1，YNB 3.4，CaCO35， 10×AA 100 mL，100×Ura、 10×His、10×Arg、10×Trp各10 mL。SD發酵培養基(g/L)：在SD-Leu培養基的基礎上添加100×Leu 10 mL/L。

1.2 儀器與設備

凝膠成像儀、PCR儀，Bio-Rad公司；高效液相色譜，有機酸色譜柱，Waters公司。

1.3 方法

1.3.1SDH2基因敲除

參照徐國強[17]的方法利用篩選標記,通過同源重組進行目的基因的敲除。

1.3.2 丙酮酸羧化酶異源表達

將本實驗室保存的攜帶有米根霉丙酮酸羧化酶的質粒pY15TEF1-RoPYC利用醋酸鋰轉化法[18]轉化至釀酒酵母琥珀酸生產菌株2-1CΔSDH2中。

1.3.3 培養方法

種子培養：從平板上挑取單菌落接種至裝有4 mL SD或SD-Leu培養基的試管中，30 ℃、220 r/min過夜培養。

發酵培養：將過夜培養的種子液接入40 mL/250 mL錐形瓶SD或SD-Leu培養基中，30 ℃、220 r/min振蕩培養。分別培養至12、24、36、48、60、72 h,取樣進行發酵產物測定。

1.3.4 酶活測定

粗酶提取：菌株進行發酵培養分別至24、36、48 h時取樣30 mL左右，在12 000 r/min條件下離心1 min，得到適量的菌體。向菌體中加入400 μL提取液，同時加入和菌體等體積的玻璃珠,在旋渦儀上進行振蕩，每振蕩30 s，立刻置于冰上1 min，重復操作10次；12 000 r/min離心10 min，取上清即為待測蛋白液。

酶活反應體系：50 μL樣本，50 μL試劑四，900 μL工作液，在340 nm的波長下測定吸光度A1和2 min后的吸光度A2，兩者差值即為ΔA。

琥珀酸脫氫酶酶活單位定義為：1 g組織1 min消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為1個酶活力單位。

琥珀酸脫氫酶酶活=

(1)

PC酶活=

(2)

1.3.5 發酵產物的分析方法

生物量測定：采用紫外可見分光光度計測定600 nm波長處的吸光值。

葡萄糖測定：采用生物傳感器SBA-40D測定葡萄糖濃度。

琥珀酸及丙酮酸測定：采用高效液相色譜，色譜柱型號：Waters Atlantis T3，4.6 mm×250 mm，5 μm；檢測條件：30 ℃柱溫；20 mmol/L NaH2PO4流動相；0.7 mL/min流速；紫外210 nm波長下檢測琥珀酸和丙酮酸產量。

2 結果與分析

2.1 SDH2缺失株的構建及SDH2基因缺失對琥珀酸積累的影響

釀酒酵母中琥珀酸進一步代謝所需的琥珀酸脫氫酶復合體由4個亞基組成，分別由基因SDH1、SDH2、SDH3、SDH4編碼[19]，其中基因SDH2的缺失使琥珀酸脫氫酶酶活下降57.8%，SDH2基因成為琥珀酸脫氫酶酶活的關鍵編碼基因。為構建琥珀酸合成途徑本研究敲除基因SDH2，分別以SDH2-A和SDH2-D引物進行PCR驗證，獲得SDH2缺失株如圖1-a所示，若敲除成功，條帶大小應為2 075 bp，否則為1 244 bp。對成功敲除菌株進行保藏和后續研究。圖1-b為構建成功的SDH2基因缺失株和野生型菌株2-1C琥珀酸脫氫酶酶活測定結果。由圖1-b可知，敲除SDH2基因后，琥珀酸脫氫酶的酶活在24、36、48 h較對照組分別下降30.32%、33.31%、57.13%，且48 h酶活最低。

圖2對SDH2缺失株和對照菌株進行了發酵性能的對比。敲除SDH2基因后，菌株2-1CSDH2發酵至48 h生物量達到最大值，較對照菌株最大生物量下降8.4%。由此可知，敲除基因SDH2未造成菌株的停滯生長，故基因SDH2并非菌株生長的必需基因。而在敲除基因SDH2后，菌株2-1CSDH2較對照菌株實現了琥珀酸積累，由(0.011±0.002) g/L提高至(0.709±0.015)g/L。同時，敲除基因SDH2后，丙酮酸的產量有所提高，如圖2-c，且發酵至36 h達到最大值(0.939±0.01) g/L，相較于原始菌株提高了47.64%。同時，由圖2(b)可知，發酵至24 h后菌株2-1CΔSDH2及對照的葡萄糖剩余量均接近0。同時發酵84 h，菌株2-1CΔSDH2葡萄糖消耗能力較對照有所下降。說明敲除基因SDH2使菌株葡萄糖消耗能力減弱。

M-marker;1-空白對照；2～5-sdh2缺失菌株圖1 sdh2缺失株PCR驗證結果(a)和菌株2-1C、2-1CΔsdh2琥珀酸脫氫酶酶活測定結果(b)Fig.1 The PCR result of strain without gene sdh2(a) and the activity of succinate dehydrogenase in strain 2-1C and 2-1CΔsdh2(b)

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖2 2-1C和2-CΔSDH2發酵曲線Fig.2 Fermentation curve of 2-1C and 2-CΔSDH2

2.2 異源表達丙酮酸羧化酶對琥珀酸積累的影響

在敲除基因SDH2后，除琥珀酸得到積累外，丙酮酸含量也提高46.7%，而丙酮酸是連接糖酵解和三羧酸循環的關鍵點[5,20-21]。因此將丙酮酸處積累的碳流量“引入”琥珀酸合成途徑成為急需解決的問題。而將丙酮酸轉化為有機酸的關鍵酶是PC酶，KENEALY等研究發現,在R.oryzae發酵生產延胡索酸的過程中，PC酶具有較高的活性[22]。為此本研究在釀酒酵母中異源表達了來自米根霉的PC酶基因。

圖3-a為異源表達丙酮酸羧化酶PYC基因獲得的轉化子菌落PCR產物圖，圖3-b比較了重組菌2-1CΔS-RoPYC和 2-1CΔSDH2丙酮酸羧化酶酶活，結果表明，發酵過程中丙酮酸羧化酶酶活呈現先增后減的趨勢，且發酵至24 h，菌株2-1CΔS-RoPYCPC酶活提高最為明顯,比菌株2-1CΔSDH2高22.5%。

在異源表達PC酶基因后，進行發酵性能測定，探究其對琥珀酸積累的作用。如圖4所示，異源表達丙酮酸羧化酶發酵至36 h，菌株2-1CΔS-RoPYC丙酮酸含量較2-1CΔS下降44.3%，同時，菌株2-1C、2-1CΔSDH2、2-1CΔSDH2-RoPYC發酵24 h后葡萄糖消耗殆盡，且葡萄糖消耗能力依次減弱。發酵至72 h琥珀酸產量達到最大值(0.841±0.020) g/L,較菌株2-1CΔSDH2提高了28.6%。說明提高PC酶的酶活促進了琥珀酸的積累。

M-marker;CK-空白對照；1～3-轉化成功的菌株圖3 異源表達RoPYC基因轉化子菌落PCR驗證凝膠電泳圖(a)和菌株2-1CΔS-RoPYC與2-1CΔS的丙酮酸羧化酶酶活(b)Fig.3 The PCR result of construct strain 2-1CΔS-RoPYC(a) and the activity of pyruvate carboxylase in strain 2-1CΔS-RoPYC and 2-1CΔSDH2(b)

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖4 菌株2-1C、2-1CΔSDH2、2-1CΔSDH2-RoPYC發酵曲線Fig.4 Fermentation curve of 2-1C，2-1CΔSDH2，2-1CΔSDH2-RoPYC

2.3 Ca2+及生物素對丙酮酸羧化酶的作用探究

在琥珀酸初步積累的基礎上通過輔因子水平探究來進一步提高丙酮酸羧化酶酶活。Ca2+作為乙酰CoA羧化酶的激活劑[23],在Ca2+存在時其酶活提高1倍。本實驗室前期研究發現在過量表達PC酶的釀酒酵母發酵中,單獨添加適量的Ca2+可以提高富馬酸的含量，因此本實驗首先考察了Ca2+的添加對PC酶活性及琥珀酸積累的作用。

在發酵36 h選擇外源添加濃度為0、25、50、75、100、125 mmol/L CaCl2溶液，探究其對丙酮酸羧化酶的影響。從實驗結果(圖5、圖6)可知，不同濃度的CaCl2溶液對PC酶的酶活作用不同。添加50 mmol/L CaCl2溶液和未添加CaCl2溶液PC酶活一致，而添加25、75、100、125 mmol/L CaCl2溶液后,PC酶活分別下降7%、30%、39%、13%。之后選擇添加0、25、125 mmol/L CaCl2溶液探究其對琥珀酸積累的影響。結果發現,加入25、125 mmol/L的CaCl2溶液后，菌體濃度上升，相較于對照增加了29.7%和107.6%，但琥珀酸產量隨Ca2+濃度增加逐漸下降，說明加入較多的Ca2+有利于菌體的生長，但卻不利于丙酮酸和琥珀酸生產。圖6(b)為添加不同濃度Ca2+后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖消耗曲線。由圖可知，添加不同濃度Ca2+后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖剩余量無明顯變化。說明Ca2+外源添加對菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖消耗能力無明顯作用。

圖5 36 h添加不同濃度Ca2+時丙酮酸羧化酶酶活Fig.5 Activity of PC enzyme with different concentrations of Ca2+ at 36 h

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖6 添加不同濃度Ca2+后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC發酵曲線Fig.6 Fermentation curve of 2-1CΔSDH2-RoPYC with diverse concentration of Ca2+

PC酶是生物素依賴型酶，在催化過程中，羧基生物素易位至羧基轉移酶結構域后轉移至受體底物丙酮酸，故缺乏生物素不利于酶促反應[24]。本實驗考察了不同濃度生物素對丙酮酸羧化酶活性及琥珀酸積累的作用。添加質量濃度為16、32、64、96 μg/L生物素,PC酶酶活較未添加生物素分別提高5.87%、22.24%、15.12%、14.05%。且添加32 μg/L生物素時，PC酶酶活提高最明顯。發酵實驗表明，添加生物素琥珀酸產量提高，且生物素質量濃度為32 μg/L時，琥珀酸產量最高，為(0.964±0.02) g/L，相較于未添加生物素提高了87.5%，但添加適當濃度生物素，丙酮酸產量下降(圖7、圖8)。由圖8(b)可知，外源添加生物素有利于菌株2-1CΔSDH2-RoPYC葡萄糖消耗能力的提高。

圖7 36 h添加不同濃度生物素時PC酶活Fig.7 Activity of PC enzyme with different concentrations of biotin at 36 h

a-生物量；b-葡萄糖；c-丙酮酸；d-琥珀酸圖8 添加不同濃度生物素后菌株2-1CΔSDH2-RoPYC發酵曲線Fig.8 Fermentation curve of 2-1CΔSDH2-RoPYC with diverse concentration of biotin

3 結論

早前已有研究人員在谷氨酸棒桿菌中共表達丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因PYC和PPC促進了琥珀酸積累[25]，且在缺乏丙酮酸羧化酶的大腸桿菌[21]中引入外源PC酶可以增強草酰乙酸的回補增加TCA循環的碳流量，從而提高琥珀酸產量。本研究敲除琥珀酸脫氫酶復合體基因SDH2，成功構建了琥珀酸合成途徑，使琥珀酸產量由(0.011±0.002) g/L提高至(0.709±0.015) g/L。在此基礎上過量表達米根霉丙酮酸羧化酶基因提高PC酶活,使琥珀酸產量進一步提高至(0.841±0.020) g/L。說明PC酶酶活提高有利于琥珀酸積累，進而探究其輔因子對琥珀酸積累作用，發現添加32 μg/L生物素,琥珀酸達到(0.964±0.02) g/L。綜上，丙酮酸羧化酶作為連接糖酵解途徑和TCA循環的節點，對琥珀酸積累起促進作用，同時也成為改造釀酒酵母積累琥珀酸的關鍵點，為代謝工程策略改造釀酒酵母積累琥珀酸提供新思路。在今后的研究中則要進一步考察PC酶不同表達量對釀酒酵母積累琥珀酸的作用。