檞皮素在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用研究

張莉莉，谷俊，董媛

(1.西電集團(tuán)醫(yī)院呼吸血液腫瘤科，陜西 西安 710077；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸二科，陜西 咸陽 712000；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院控感辦，陜西 西安 710054)

目前，全世界的肺癌發(fā)病率及死亡率均高居不下，且發(fā)病率一直呈上升趨勢。我國屬于肺癌的高發(fā)國家[1-2]，發(fā)病人群主要為老年人，年齡大部分集中在65～75歲[3]，每年因肺癌死亡的人數(shù)占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的20%～25%[4]，其中因非小細(xì)胞癌死亡的人數(shù)占所有肺癌死亡人數(shù)的80%[5]。因此，為提高腫瘤的臨床診斷技術(shù)，對腫瘤發(fā)生的分子機制和發(fā)現(xiàn)特異的腫瘤相關(guān)分子必須予以高度關(guān)注。然而，目前非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展的具體環(huán)節(jié)及機制尚未完全清楚。

檞皮素是一種具有多種生物活性且無毒副作用的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜及中草藥中。黃酮類化合物是中藥的有效成分，具有活血化瘀的功效。因此推測檞皮素對肺癌的治療可能有一些功效。此外，檞皮素還具有較強的抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖的作用[6-7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)檞皮素的藥理作用廣泛[8]，對多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用，其抗腫瘤活性越來越引起研究者的關(guān)注。因此，本研究擬通過非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)來研究檞皮素對其活性的影響機制，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供可能的參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集

臨床標(biāo)本來源于2016年3月至2018年10月武漢協(xié)和醫(yī)院胸外科接受外科手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者44例。納入標(biāo)準(zhǔn)：有詳細(xì)的臨床病理資料；臨床樣本均經(jīng)過兩名有經(jīng)驗病理醫(yī)師診斷確認(rèn)；病理分型為鱗癌和腺癌；患者均為初次治療，術(shù)前均未接受放療和化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：認(rèn)知功能障礙者；合并其他嚴(yán)重的心肝肺功能障礙、腫瘤者；免疫缺陷者。其中男性26例，女性18例，平均年齡(55.6±7.0)歲；鱗癌20例、腺癌24例；TNM分期為I期13例、II期19例、III期7例、IV期5例。取手術(shù)中的病理組織，原代分離細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-16和HOXA10表達(dá)情況，觀察檞皮素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力的影響。

1.2 miRNA-16和HOXA10的檢測

采用TriZol試劑提取各臨床分期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的總RNA，采用實時定量PCR法檢測細(xì)胞中miRNA-16和HOXA10的表達(dá)。

1.3 細(xì)胞活力檢測

采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。將細(xì)胞以每孔2×103個細(xì)胞接種于96 孔板上，于37 ℃及5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待藥物作用后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在酶標(biāo)儀上檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次，計算各組細(xì)胞的存活率。

1.4 檞皮素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力的影響

參照文獻(xiàn)報道[1]，采用50 μmol/L的檞皮素作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞48 h后，分別檢測作用前后miRNA-16和HOXA10表達(dá)和細(xì)胞活力變化。

1.5 檞皮素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡率的影響

50 μmol/L檞皮素作用48 h后，每孔加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液，立即經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同臨床分期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miRNA-16和HOXA10的表達(dá)水平比較

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miRNA-16和HOXA10的表達(dá)水平隨著患者的臨床分期增加而不斷增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

組別Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)miRNA-160.124±0.060.236±0.06?0.454±0.08?#0.634±0.10?#△HOXA100.187±0.040.332±0.05?0.632±0.09?#0.823±0.11?#△

*P<0.01，與Ⅰ期比較；#P<0.01，與Ⅱ期比較；△P<0.01，與Ⅲ期比較。

2.2 檞皮素作用于不同臨床分期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后細(xì)胞中miRNA-16和HOXA10的表達(dá)水平

在檞皮素作用下，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miRNA-16和HOXA10的表達(dá)水平在各組臨床患者中均有所下降，且與作用前相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

時期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)miRNA-16作用前0.124±0.060.236±0.060.454±0.080.634±0.10miRNA-16作用后0.083±0.08?0.132±0.05?0.258±0.09?0.442±0.09?HOXA10作用前0.187±0.040.332±0.050.632±0.090.823±0.11HOXA10作用后0.114±0.02?0.237±0.04?0.455±0.06?0.671±0.09?

*P<0.01，與作用前比較。

2.3 檞皮素作用下不同臨床分期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性變化

細(xì)胞活力測試顯示，檞皮素作用后臨床Ⅰ期-Ⅳ期細(xì)胞存活率均顯著低于作用前(P<0.05)。見表3。

時期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)作用前101.41±6.42114.50±10.51139.20±11.90155.15±15.32作用后78.31±6.21?81.67±8.19?90.91±12.54?100.32±12.53?

*P<0.01，與作用前比較。

2.4 檞皮素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡率的影響

檞皮素作用后臨床Ⅰ期-Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡率均顯著高于作用前(P<0.05)。見表4。

時期Ⅰ期(n=13)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=7)Ⅳ期(n=5)作用前5.89±1.125.78±1.155.79±1.345.88±1.25作用后12.56±4.07?13.21±4.13?13.65±4.16?15.34±4.21?

*P<0.01，與作用前比較。

3 討論

目前非小細(xì)胞肺癌的治療手段主要以手術(shù)、放療、化療和靶向治療為主，非小細(xì)胞肺癌在臨床上最為常見，發(fā)病率和死亡率均居高不下，但發(fā)病機制目前尚不明確，因此，為減輕患者放化療的不良反應(yīng)，延長患者的生存期，有中醫(yī)醫(yī)師提出以辨證論治為基礎(chǔ)，運用中醫(yī)藥的方法來有效控制肺癌疾病的進(jìn)展[9]。許玲等[10]應(yīng)用人肺腺癌LAX-83裸小鼠模型觀察益肺抗瘤飲(主要含黃芪、北沙參、天冬、女貞子、七葉一枝花等)對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)益肺抗瘤飲可降低Ki-67的陽性率，并降低C-myc蛋白的表達(dá)，益肺抗瘤飲可通過改變肺癌基因表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞的增殖。檞皮素作為一種黃酮類的中草藥有效成分，其對肺癌的作用機制還尚未徹底闡明。

目前，很多研究表明檞皮素對多種腫瘤細(xì)胞均存在一定的抑制作用，具有抗炎、抗氧化、擴(kuò)張血管作用，其抗腫瘤的活性得到了廣泛的關(guān)注[11]。自然界中具有豐富的檞皮素資源，主要以糖苷的形式存在于植物中，含量豐富，且檞皮素的藥理作用廣泛而強大，存在于蔬菜、水果及中草藥之中，便于提取，分離和利用[12]。在抗肺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)檞皮素能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞NCL-H460凋亡，且隨著藥物的濃度增加凋亡率也在增加[13]，說明檞皮素在肺癌細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮著重要作用，可能與激活下游的信號通路有關(guān)。miR-16作為一種與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的miRNA，位于DLEU2基因的內(nèi)含子區(qū)域，其低水平能夠抑制腫瘤的遷移和侵襲，是肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素[14]。胃癌、乳腺癌、胰腺癌等中均可見miR-16的表達(dá)下調(diào)[15]。HOXA10是同源盒(HOX)基因家族中的一員，在調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、口腔癌等多種癌組織中均有HOXA10的過度表達(dá)[16]。因此，本研究將miR-16和HOXA10作為非小細(xì)胞癌檢測的標(biāo)記物。

本次研究結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌Ⅰ期-Ⅳ期患者中，miR-16和HOXA10的表達(dá)水平隨著患者的臨床分期增加而不斷增加，說明miR-16和HOXA10的表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。提示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與miRNA-16和HOXA10的過度表達(dá)有關(guān)。在檞皮素作用下，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-16和HOXA10的表達(dá)水平在各組臨床患者中均顯著低于作用前，說明檞皮素能夠抑制miR-16和HOXA10的表達(dá)。檞皮素作用后臨床Ⅰ期-Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞存活率顯著低于作用前臨床Ⅰ期-Ⅳ期細(xì)胞存活率，且Ⅰ期-Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡率均顯著高于作用前。表明檞皮素能夠抑制非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞的凋亡，而這一作用可能是通過抑制miR-16和HOXA10的表達(dá)完成，推測可能是由于檞皮素通過調(diào)控miR-16/HOXA10軸抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的活性。本研究結(jié)果也提示，miR-16和HOXA10可能是一種抑癌基因，與在其它系統(tǒng)的腫瘤疾病的研究結(jié)果一致。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-16和HOXA10的表達(dá)水平隨著患者的臨床分期增加而升高。檞皮素能夠有效抑制miR-16和HOXA10的表達(dá)，對各個時期非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞均有抑制效果。檞皮素能夠降低抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的活性，增加其凋亡率。因此miR-16和HOXA10的表達(dá)水平異常升高可能是非小細(xì)胞肺癌發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)之一。

本研究存在一定的不足，非小細(xì)胞肺癌占肺癌的大多數(shù)，細(xì)胞類型也很多，但此次研究所涉及的細(xì)胞類型較單一，而且 miRNAs是一大類RNA，其所能調(diào)控的靶mRNA也紛繁復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究，如多種類型的納入，更多病例的檢測及進(jìn)一步臨床驗證等。