銀屑病患者外周血Th17、Treg細胞檢測及臨床意義

丁小潔，王亞琴，劉艷

(1.川北醫學院附屬醫院皮膚科；2.川北醫學院附屬醫院病理科，四川 南充 637000)

銀屑病是一種具有特征性皮損的慢性復發性炎癥性皮膚病，通常表現為紅色丘疹或斑塊，上覆厚層銀白色鱗屑，刮除銀白色鱗屑，可觀察到蠟滴現象、薄膜現象、點狀出血。因反復發作，導致患者生活質量降低。迄今為止，銀屑病的病因及發病機制尚不明確[1-2]。近年的研究[3-4]發現，輔助型T細胞17(Th17)能夠通過分泌炎癥介質如IL-17、IL-22等來介導炎癥反應，被認為是銀屑病發病的主要環節之一。調節性T細胞(Treg)是一種具有免疫調節功能的T細胞，能夠參與機體的免疫應答與耐受[5-6]。近年來，一些學者認為[7-8]，Treg細胞、Thl7細胞與免疫性疾病的發病、慢性皮膚炎癥的進展具有密切的相關性。本課題擬通過對銀屑病患者外周血Th17細胞、Treg細胞的表達水平的研究并分析其臨床意義，為探尋銀屑病治療的新方法提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取川北醫學院附屬醫院2017年1月至2018年2月門診患者、住院患者及健康體檢者共96 例。其中，銀屑病患者34 例，一般慢性皮膚病患者30 例(濕疹14 例、慢性蕁麻疹7 例、體癬5 例、大皰性類天皰瘡4 例)，健康對照組32 例，所有研究對象均經過醫院倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集所有參與對象晨起空腹靜脈血5 mL，置于加有EDTA-K2抗凝液的EP管中，冷藏-20 ℃冰箱中備用。主要應用于流式細胞儀檢測。

1.2.2 主要試劑與儀器 改良型RPMI1640培養液產自北京賽默飛生物有限公司；胎牛血清產自北京索萊寶科技有限公司；莫能霉素、離子霉素、佛波酯(PMA)來自BD Bioscience；PBS緩沖液為自配。流式細胞儀CANTO型產自美國BD公司，PCR擴增儀ABIABI5700來自美國BD公司。

1.2.3 細胞檢測方法 (1) Th17細胞的檢測：將新鮮抗凝血樣與1640培養基均200 μL混勻，分別加入離子霉素、PMA和莫能霉素，繼續培養于37 ℃、5% CO2條件下。熒光素標記單克隆抗體CD3-FITC、CD8-PECy加入到培養后的全血細胞中，在培養箱中避光培養。紅細胞經過裂解液處理后，PBS緩沖液沖洗，經過破膜劑及PBS處理后，加入抗人lL-17-PE抗體，室溫避光孵育，PBS洗滌后立即上流式細胞儀機檢測，整個過程設置陰性對照組；(2)Treg細胞的檢測：將新鮮抗凝血樣100 μL，加入Tregcooktail試劑20 μL，室溫避光孵育，裂解紅細胞，PBS洗滌。立即上流式細胞儀機檢測，整個過程設置陰性對照組。

1.2.4 血清中炎癥因子的檢測 采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清中IL-10、IL-17、IL-22和TGF-β的水平，試劑盒均為美國RD公司產品，并嚴格按照說明書步驟操作。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 3組外周血Th17細胞和Treg細胞檢測結果比較

3組患者Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg比值的方差檢驗，差異有統計學意義(P<0.05)。通過兩組t檢驗結果分析發現，銀屑病患者Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg比值高于慢性皮膚病患者組及健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組外周血Th17細胞和Treg細胞檢測結果比較

*P<0.05，與健康對照組相比；#P<0.05：與慢性皮膚病組相比。

2.2 各組患者血清中IL-10、IL-17、IL-22和TGF-β的水平

銀屑病組患者血清中IL-10及TGF-β水平較慢性皮膚病組及健康對照組患者均有下降，差異有統計學意義(P<0.05)。銀屑病組患者血清中IL-17、IL-22水平較慢性皮膚病組及健康對照組患者均有升高，差異有統計學意義，P<0.05。見表2。

表2 各組患者血清中IL-10、IL-17、IL-22和TGF-β的水平

*P<0.05，與健康對照組相比，#P<0.05，與慢性皮膚病組相比。

2.3 銀屑病患者外周血Th17細胞、Treg細胞與血清中炎癥因子的相關性

銀屑病患者外周血Th17細胞、Treg細胞水平與IL-10、TGF-β水平呈負相關(P<0.05)；銀屑病患者外周血Th17細胞、Treg細胞水平與IL-17、IL-22呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3銀屑病患者外周血Th17細胞、Treg細胞與血清中炎癥因子的相關性

變量IL-10r值P值IL-17r值P值IL-22r值P值TGF-βr值P值Th17-0.7330.0130.8320.0010.8210.001-0.8660.001Treg-0.8190.0060.8550.0000.8740.000-0.8590.001

3 討論

銀屑病是一種慢性復發性炎癥性皮膚病，皮損組織中的大量T淋巴細胞及相關細胞因子形成異常的免疫微環境導致表皮角質形成細胞異常分化[9]。但銀屑病的發病機制目前尚不清楚。有學者認為Th17作為一種新型輔助性T細胞，能夠分泌IL-17、IL-22等細胞免疫因子，與免疫性疾病及炎癥性疾病的發生有著密不可分的關系[10]。本次研究發現，銀屑病組患者外周血中Th17細胞表達含量較慢性皮膚病組及健康對照組均有升高，差異有統計學意義(P<0.05)，提示在銀屑病患者體內Th17細胞的表達增多。國外有學者[11]發現，Th17細胞在患者的皮損處大量聚集，真皮層含量水平增高，且其mRNA的表達與疾病活動程度相關。也有學者發現，在銀屑病患者外周血中IL-17、IL-22的表達含量升高，可能是由于外周血中Th17細胞表達增加，促使血清中IL-17、IL-22等炎癥因子的含量增加。本研究也發現，銀屑病患者血清中IL-17、IL-22的水平顯著高于一般慢性皮膚病患者及健康對照者，且Th17水平與IL-17、IL-22水平呈正相關。另有研究[12]發現，當患者使用依那西普治療銀屑病時，患者血清中IL-17、IL-22的水平明顯下降，皮損的嚴重程度也得到了緩解，提示Th17細胞可能參與銀屑病的炎癥過程，增加局部病變的炎癥反應。

IL-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子，調節細胞的生長與分化，參與炎性反應和免疫反應，是目前公認的炎癥與免疫抑制因子，影響單核巨噬細胞主要功能，即釋放炎癥介質及抗原呈遞。TGF-β是屬于一組新近發現的調節細胞生長和分化的TGF-β超家族，對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用，研究發現對于IL-17、IL-22等因子均具有重要的正相關調控作用。Treg細胞屬于T細胞亞群，具有免疫抑制功能，能在TCR、IL-2等信號的刺激下活化成為效應T細胞，也能誘導非特異性抑制CD4+、CD8+細胞、自然殺傷細胞等其他免疫細胞的活化和增殖。因此，Treg細胞在體內能夠抑制腫瘤免疫、抑制自身免疫性疾病的發生，并能夠維持機體內環境的穩態[13-14]。通過Th17與Treg細胞間的動態平衡，保持機體免疫功能的正常運轉，打破這一平衡關系，可導致許多免疫相關性疾病及炎癥反應[15]。本研究結果顯示，在銀屑病患者外周血中Treg細胞表達水平顯著高于慢性皮膚病組及健康對照組，且Treg的表達水平與IL-17、IL-22水平呈正相關，而Th17/Treg比值較慢性皮膚病組及健康對照組也有升高，說明銀屑病患者外周血中Th17與Treg的動態平衡發生了變化，這也可能是激活機體異常免疫反應的其中一環。本文研究還提示，通過監測患者免疫指標的變化，能有效預測或者評估銀屑病的病情及治療效果。

綜上所述，銀屑病患者外周血中Th17、Treg細胞二者表達水平升高，Th17/Treg比值升高，提示Th17、Treg細胞兩者可能參與銀屑病的發病，而阻斷兩者的產生途徑可能成為治療銀屑病的新方法。