鹽酸米諾環素對牙周炎大鼠的治療效果及對大鼠IL-8、hs-CRP、TNF-α的影響

劉永召，鄭瑞，韓淑伶

(1.武警天津市總隊醫院五官科，天津 300162；2.天津市第三中心醫院神經外科，天津 300170)

牙周炎是一種常見的慢性牙科疾病，主要是由細菌感染及其細菌產物造成，所以對牙部病菌的抑制成為治療牙周炎的關鍵手段[1]。目前，臨床上一般采用機械治療慢性牙周炎，主要是去除牙菌斑和牙結石，并且服用抗生素進行輔助治療[2]。鹽酸米諾環素作為一種廣譜類抗菌素，能夠對各類的牙周炎病菌起到很好的控制效果，已成為治療牙周炎的主要藥物[3]。本研究通過構建牙周炎大鼠模型，對牙周炎大鼠分別給予碘甘油和鹽酸米諾環素進行治療，探究鹽酸米諾環素對牙周炎的臨床效果?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取由解放軍總醫院實驗動物研究中心提供的120例Wistar大鼠，雌雄不限，年齡3～6個月，平均年齡(3.8±1.5)月，體重200～250 g，平均(220±7.9)g。所有大鼠均養殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水。經過1周飼養后，隨機分為基礎治療組和鹽酸米諾環素組，每組各60例，兩組大鼠的年齡、體重比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，實驗已經過倫理會批準。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎大鼠模型建立 給予120例大鼠靜脈注射30 g/L戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后將大鼠右上頜第1個磨牙牙周和牙根面分離，然后使用正畸鋼絲將牙頸部結扎，喂養大鼠高糖飼料，包括：蔗糖55 g，脫脂奶粉30 g，酵母粉5 g，面粉5 g，肝粉2 g，200 g/L的高糖水以及少量的食鹽和新鮮蔬菜，喂養持續4周后，檢測探診深度，深度達到2 mm以上說明大鼠牙周炎模型建立成功，若達不到則繼續喂養，直至模型成功建立。

1.2.2 治療方法 兩組大鼠在用藥治療前均采取牙齦清潔手段和牙齦刮治清除術等常規治療，待大鼠炎癥擴散情況穩定后對兩組大鼠采取用藥物治療。基礎治療組大鼠采用碘甘油進行治療，采用無菌鑷子加入無菌棉浸泡入碘甘油中，吸滿之后涂抹于大鼠的牙周袋上，每天涂抹2次，涂抹4周。鹽酸米諾環素組大鼠采用鹽酸米諾環素進行治療，將裝有鹽酸米諾環素的注射劑垂直深入大鼠的牙周袋內，緩慢勻速推進牙周袋內使其注滿并且溢出為止，每周用藥1次，治療4周。在治療后1 h內禁止大鼠飲水或者進食，防止藥物的濃度降低影響治療效果。治療結束后觀察大鼠一般形態，并作記錄。

1.2.3 切片及染色 隨機選取兩組中1只大鼠靜脈注射30 g/L戊巴比妥鈉麻醉處死后，取大鼠實驗側頜骨進行固定、脫鈣、包埋處理，并做石蠟切片。對兩組大鼠切片樣本進行染色處理，使用二甲苯進行常規脫蠟處理2次，每次5 min，然后在梯度酒精下水花處理3 min，自來水沖洗1次；使用蘇木素染色5 min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸酒精分化處理30 s，在0.2%氨水中反藍處理2 min，自來水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片，使用光學顯微鏡進行圖像分析。

1.2.4 標本采集 將大鼠固定后，將大鼠尾部浸泡置50 ℃溫水中2 min后擦干鼠尾，用手術剪剪去大鼠尾尖7 mm，采集血液5 mL，放置在干凈EP管中，做好標志后凍存置-50 ℃冰箱中，用于外周血中白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、超敏C-反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測；將待測大鼠用乙醚麻醉后，斷頭處死，5 min內切去大鼠右上頜第1、2磨牙頰腭側實驗處的牙齦組織，加入其20倍體積的離心緩沖液，手動均槳10 min，用離心機以2 000 r/min的轉速分離，取上層血漿電動勻漿后，用離心機以3 000 r/min的轉速分離，取上層血漿放置-50 ℃的冰柜中凍存，用于牙齦組織中IL-8、hs-CRP、TNF-α檢測。竊取大鼠M2磨牙區組織塊，在沸騰的蒸餾水中蒸煮5min后取出，刮去其附著的軟組織，帶冷卻后放入3%的過氧化氫溶液中過夜，然后用0.1%的亞甲基藍染色，1 min后吸去多余染液，使其自然風干，用于牙槽骨吸收長度及面積的檢測。

1.2.5 ELISA法檢測IL-8、hs-CRP、TNF-α表達 采用酶聯免疫吸附法，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在ELISA試劑盒中加入待測樣本，使血清和固相抗原充分結合，洗滌去除雜質后加入微孔板酶標儀中，經過酶標抗體反應形成復合物后再加入底物顯色，通過比色檢測血清中IL-8、hs-CRP、TNF-α的量，進行指標水平比較。

1.2.6 臨床指標檢測 兩組大鼠在治療前和治療4周后對牙部的臨床指標進行檢測評分，檢測大鼠牙周PD、PLI以及SBI指數評分，判定大鼠治療前PD、PLI和SBI的指標水平和治療后的水平差異。PD指數評分：0分表示探診深度為1～2 mm；1～3分表示探診深度為3～5 mm；4～5分表示探診深度≥5 mm。PLI指數評分：0分表示牙齦邊緣區沒有菌斑；1分表示牙齦邊緣區有很薄的菌斑，但可以忽略；2分表示牙齦邊緣有中等量的菌斑覆蓋；3分表示牙齦邊緣及鄰近部位有大量菌斑覆蓋。SBI指數評分：1分表示基本健康有輕度炎癥，齦溝不出血；2分表示輕度炎癥探診后點狀出血；3分表示牙齦有中度炎癥，牙齦血不溢出；4分表示牙齦有中度炎癥，牙齦血溢出；5分表示重度炎癥，明顯腫脹，自動出血。

1.2.7 M2腭側牙槽骨吸收長度和吸收面積測定 使用體視鏡拍攝標本同一水平腭側，取M2腭側釉牙骨質界近中、根分叉處以及遠中各3個點位，用體視鏡CCD自帶軟件測量這3個點位與牙槽嵴頂的距離，3個長度之和即為M2腭側牙槽骨吸收長度。用體視鏡CCD自帶軟件測量M2腭側染色面積，即M2腭側牙槽骨吸收面積。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般形態觀察

如圖1所示，基礎治療組大鼠食欲略有回升，毛色逐漸變亮，精神狀態有所恢復，牙齦炎癥逐漸減輕，仍可見有牙周袋，探診有出血現象，但出血均在牙齦溝內，牙周組織有所恢復。鹽酸米諾環素組大鼠食欲恢復正常，毛色光亮，具有良好的精神狀態，大鼠牙齦處無紅腫現象，牙面與牙齦組織緊密貼合，探診無出血，較基礎治療組大鼠牙周袋顯著變淺，存在明顯修復的牙周組織跡象。

2.2 病理組織學觀察

如圖2所示，為兩組大鼠牙周組織病理學觀察圖，基礎治療組大鼠病理圖顯示牙周袋內存在大量的炎性細胞，牙周膜纖維排列不齊，可見牙槽面存在骨吸收陷窩，可見破骨、成骨細胞，牙齦上皮及皮下結締組織存在炎性浸潤；鹽酸米諾環素組大鼠病理圖顯示炎癥反應較基礎治療組明顯減少，牙周膜纖維排列整齊，成纖維細胞增多，牙齦上皮及皮下結締組結構完整，牙槽面有大量的成骨細胞。

2.3 外周血及牙齦組織中IL-8表達水平比較

如表1所示，基礎治療組和鹽酸米諾環素組大鼠在治療前外周血及牙齦組織中IL-8表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組大鼠治療后外周血及牙齦組織中IL-8表達水平均顯著低于治療前(P<0.05)；鹽酸米諾環素組大鼠在治療后外周血及牙齦組織中IL-8表達水平均明顯低于基礎治療組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

組別外周血中IL-8(pg/mL)治療前治療后牙齦組織中IL-8(μg/L)治療前治療后基礎治療組(n=60)2.01±0.061.57±0.040.72±0.040.37±0.02鹽酸米諾環素組(n=60)1.99±0.071.39±0.050.71±0.050.29±0.02t值1.6821.771.2121.91P值>0.05<0.05>0.05<0.05

2.4 外周血及牙齦組織中hs-CRP表達水平比較

如表2所示，基礎治療組和鹽酸米諾環素組大鼠在治療前外周血及牙齦組織中hs-CRP表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組大鼠治療后外周血及牙齦組織中hs-CRP表達水平均低于治療前(P<0.05)；鹽酸米諾環素組大鼠在治療后外周血及牙齦組織中hs-CRP表達水平均明顯低于基礎治療組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

組別外周血中hs-CRP(ng/mL)治療前治療后牙齦組織中hs-CRP(mg/L)治療前治療后基礎治療組(n=60)17.85±4.6511.25±3.496.50±0.054.37±0.06鹽酸米諾環素組(n=60)17.06±5.347.84±2.826.51±0.064.12±0.35t值0.865.890.995.45P值>0.05<0.05>0.05<0.05

2.5 外周血及牙齦組織中TNF-α表達水平比較

如表3所示，基礎治療組和鹽酸米諾環素組大鼠在治療前外周血及牙齦組織中TNF-α表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組大鼠治療后外周血及牙齦組織中TNF-α表達水平均顯著低于治療前(P<0.05)；鹽酸米諾環素組大鼠在治療后外周血及牙齦組織中TNF-α表達水平均明顯低于基礎治療組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.6 PD、PLI和SBI指標比較

如表4所示，兩組大鼠經過治療后，PD、PLI和SBI指標相比治療前明顯降低，鹽酸米諾環素組大鼠治療后的PD、PLI和SBI水平低于基礎治療組，差異具有統計學差異(P<0.05)。

組別外周血中TNF-α(ng/L)治療前治療后牙齦組織中TNF-α(pg/mL)治療前治療后基礎治療組(n=60)9.31±2.566.17±1.824.62±0.973.21±0.55鹽酸米諾環素組(n=60)9.27±2.143.74±1.174.58±1.021.97±0.48t值0.098.700.2213.15P值>0.05<0.05>0.05<0.05

表4 兩組大鼠治療前后PD、PLI和SBI比較

2.7 M2腭側牙槽骨吸收長度和吸收面積比較

如表5所示，鹽酸米諾環素組大鼠治療后M2腭側牙槽骨吸收長度和吸收面積均明顯低于基礎治療組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

組別M2腭側牙槽骨吸收長度(mm)M2腭側牙槽骨吸收面積(mm2)基礎治療組(n=60)0.37±0.032.84±1.23鹽酸米諾環素組(n=60)0.29±0.021.65±0.64t值17.186.81P值<0.05<0.05

3 討論

牙周炎是一種常見的炎癥疾病，發病原因主要是患者口腔內部受到了細菌感染，從而導致了牙齦的萎縮，對牙周組織產生了嚴重的破壞性[4]?；加醒乐苎椎牟糠只颊邥霈F前牙位移狀況，致使牙周袋深度增加，產生牙齒松動、間隙加寬、出現咀嚼功能障礙等一系列問題[5]。目前，對齦下菌斑、牙結石和牙骨質病變的主要治療手段是牙周刮治、牙菌斑的去除等一些基礎治療，隨后局部給藥。鹽酸米諾環素在四環素類藥物中抗菌性最強，對革蘭陽性菌和陰性菌均有效，可滅活齦溝液中膠原酶，在局部長期形成高濃度而發揮抗菌作用。它還能使牙根面脫鈣，刺激結締組織中細胞在根面上遷移，促進細胞附著和生長，促進局部組織恢復，降低血清中炎性因子的表達水平。

hs-CRP是機體內血漿中的一種C反應蛋白，由肝臟合成，是全身炎癥反應急性期的非特異性標志物，是預測心血管疾病最重要的預測因子之一[6]。在新生兒細菌感染、腎移植以及心血管疾病等方面均有極為重要的臨床指導作用。本研究表明，牙周炎大鼠經鹽酸米諾環素給藥后，其血清中hs-CRP的水平比經基礎治療的大鼠更低。這可能是因為經鹽酸米諾環素治療后，大鼠患病部位菌斑減少，炎癥減輕，對肝臟的刺激減弱，致使hs-CRP的表達減少。

TNF-α主要由巨噬細胞及單核細胞分泌產生，參與機體內正常的炎癥反應及免疫反應[7]。TNF-α是目前醫學界發現的活性最強的抗腫瘤細胞因子,它可以刺激中性粒細胞發揮作用，而且少量的TNF-α還有殺滅癌細胞的作用[8]。TNF-α可以作用于多種細胞，可以誘導IL-1β、IL-6、IL-8在人體內的分泌，從而導致白細胞、毛細血管組織的損壞，最終對全身器官及組織造成損害[9]。本研究表明，牙周炎大鼠經鹽酸米諾環素給藥后，其血清中TNF-α的水平比經基礎治療的大鼠更低。這可能是因為經鹽酸米諾環素治療后，大鼠牙周炎微生物減少，對TNF-α基因啟動子的刺激減弱，使TNF-α的表達減少。

IL-8屬于趨化家族的細胞因子，主要由單核巨噬細胞分泌產生，在哺乳動物生殖生理及病理過程中有重要的調節作用，IL-8幾乎參與了哺乳動物的整個生殖及生長發育的過程[10]。IL-8主要的生物學活性是吸引及激活中性粒細胞，并釋放一系列的活性產物，最終會導致機體局部的炎癥反應，從而達到殺菌和細胞損傷的目的[11]。本研究表明，牙周炎大鼠經鹽酸米諾環素給藥后，其血清中IL-8的水平較經基礎治療的大鼠低。這可能是由于經鹽酸米諾環素治療后，大鼠牙周炎病情減緩，TNF-α表達水平降低，對中性粒細胞的刺激作用減弱減少，因而IL-8的表達水平也隨著降低。

hs-CRP、TNF-α、IL-8均屬于炎癥因子。本文研究表明，牙周炎大鼠經過鹽酸米諾環素治療后，外周血及牙齦組織中hs-CRP、TNF-α、IL-8均有顯著降低，說明鹽酸米諾環素可以有效抑制牙周炎大鼠炎癥反應的發生。李會英等[12]研究表明，牙周炎大鼠在經過治療后，外周血中IL-8表達水平明顯降低，與本文研究結果一致。但在其研究中，牙周炎大鼠經過治療后IL-8表達水平低于本文研究結果，可能是與研究選取大鼠樣本數有關，本文研究選取大鼠樣本數量較多，結果可能會更加確切。

PLI稱菌斑指數，主要是一種通過人體牙齒部位牙面的菌斑厚度來制定的一個評分標準，一般用于口腔衛生的評價和對牙周病的預防[13]；SBI稱齦溝出血指數，主要是對患者牙齦的出血量做一個評分標準，能夠更準確的反應炎癥的程度[14]；PD稱探診深度，主要是通過使用牙周探針來測量患者的齦袋和牙周袋的深度，就是牙齦邊緣到齦溝底部的距離，也是一項非常重要的牙周指標[15]。本文研究結果表明，鹽酸米諾環素可以顯著降低牙周炎大鼠PLI、SBI、PD指標水平及牙周炎大鼠M2腭側牙槽骨吸收長度和吸收面積，治療效果顯著。

綜上所述，鹽酸米諾環素可以顯著降低牙周炎大鼠外周血及牙齦組織中炎癥因子水平，保護牙周組織，降低患者各項牙部臨床指標水平及M2腭側牙槽骨吸收長度和吸收面積，鹽酸米諾環素對牙周炎可能會有顯著的治療效果。