Notch信號通路調控CD4+T細胞分泌IL－22在Vogt－小柳原田綜合征中的作用

儲昭節，王 彤，馬 強，范晶晶，蔡 敏

作者單位:(710002)中國陜西省西安市第一醫院眼科西安市眼科醫院陜西省眼科研究所

0 引言

Vogt－小柳原田(Vogt－Koyanagi－Harada syndrome，VKH)綜合征是一種由自身免疫反應引發的攻擊黑色素細胞抗原導致的致盲性眼病，以雙側肉芽腫性全葡萄膜炎為主要特征，還可侵襲耳、腦脊髓膜、毛發、皮膚等器官［1］。VKH綜合征的發病機制尚未完全闡明，病毒感染、自身免疫等因素均參與了VKH的發病。白細胞介素(interleukin，IL)－22屬于 IL－10細胞因子家族成員，主要由CD4+T細胞分泌，IL－22的受體僅表達在組織器官的實質細胞中，因此IL－22介導的信號通路主要參與組織器官炎癥應答的調控，在腫瘤、感染和自身免疫性疾病中均發揮重要的調控作用［2－3］。IL－22的表達受多種因素的調控，研究發現Notch信號通路可通過誘導芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)表達調控CD4+T細胞分泌 IL－22，誘導肝臟炎癥應答［4－6］。但有關 IL－22 在VKH綜合征患者中的表達及其調控機制尚未見相關報道。因此，本研究觀察了Notch受體和IL－22在VKH綜合征患者中的表達，并評估VKH患者中Notch信號通路對CD4+T細胞分泌IL－22的調控作用，以期初步闡釋VKH綜合征的免疫發病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016－09/2018－06本院就診的VKH綜合征患者35例，其中活動期15例，男8例，女7例，年齡29～55(平均39.0±11.9)歲，活動期患者采集標本時未接受任何藥物治療;靜止期20例，男10例，女10例，年齡31～54(平均39.2±12.1)歲，靜止期患者使用免疫抑制劑治療1a以上，炎癥靜止3mo以上。納入標準:(1)年齡18～65歲;(2)符合國際命名委員會的標準以及楊培增教授提出的參考標準［1，7］;(3)獲得知情同意。排除標準:(1)合并慢性病毒感染;(2)合并其他自身免疫性疾病;(3)合并惡性腫瘤;(4)合并心、腦、肺、肝臟等重要臟器功能障礙;(5)妊娠期或哺乳期婦女。選取同時期在我院進行體檢的12例志愿者作為健康對照者，男7例，女5例，年齡28～55(平均37.1±10.8)歲，健康對照的年齡和性別比例與VKH綜合征患者的差異無統計學意義(P＞0.05)。本研究方案已經在本院倫理委員會備案并獲得批準，所有研究對象均對本研究了解并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血漿和CD4+T細胞的分選 清晨、空腹采集研究對象EDTA抗凝外周血10mL，3 000g/min離心10min，收集上層血漿，凍存于－80℃備用。下層血細胞使用Ficoll淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)、采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，使用CD4+細胞分選試劑盒(德國美天旎公司)按說明書要求分選外周血單個核細胞中的CD4+T細胞。

1.2.2 CD4+T細胞的刺激 培養取106個分選的CD4+T細胞，加入抗CD3/CD28抗體(終濃度1μg/mL)，同時加入Notch信號通路抑制劑DAPT(美國Selleck公司，終濃度75μmol/L)刺激培養48h后收集培養細胞和上清。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR) 使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA，取1μg總RNA，使用反轉錄試劑盒(瑞士羅氏公司)將總 RNA反轉錄為 cDNA，使用FastStart DNA Master SYBR Green I實時定量PCR試劑盒(瑞士羅氏公司)對目的片段進行擴增，引物序列根據既往文獻［5，8］合成。采用50μL反應體系，反應條件:預變性:94℃ 5min;PCR 反應 94℃ 10s，50℃ 20s，72℃ 30s，共35個循環。應用2－ΔΔCt法對目的片段的相對表達量進行分析。

1.2.4 Western blot 取 5×105個 CD4+T細胞，加入250μL 2×SDS 緩沖液+5μL β－巰基乙醇裂解細胞，孵育5min后于95℃靜置10min，離心后將待測樣本加入SDSPAGE電泳濃縮膠孔中，100V將蛋白分離后電轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的PBS－T封閉1h，洗滌后分別加入抗Notch1抗體(1∶500稀釋)、抗 Notch2抗體(1∶200稀釋)、抗 Notch3抗體(1∶400 稀釋)、抗 Notch4 抗體(1∶700稀釋)、抗 Hes－1抗體(1∶1000稀釋)、抗 Hes－5抗體(1∶1000稀釋)或抗GAPDH 抗體(1∶2000稀釋)(所有抗體均購自美國Abcam公司)，4℃孵育過夜。洗滌后加入抗兔或抗小鼠IgG－HRP(1∶2000稀釋)，室溫孵育2h。洗滌后利用化學發光法成像。

1.2.5 酶聯免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) 使用商品化人 IL－22 ELISA檢測試劑盒(美國R＆D公司)對血漿和培養上清中IL－22表達水平進行檢測，操作嚴格按說明書要求進行。

1.2.6 流式細胞術 分選的CD4+T細胞使用佛波酯(終濃度50ng/mL)和伊烏諾霉素(終濃度1μg/mL)刺激培養12h，同時加入莫能霉素(終濃度10μg/mL)抑制蛋白轉運。收集細胞轉入FACS管中，加入抗CD4－APC(美國BD公司)進行表面染色，4℃避光孵育20min，洗滌后加入破膜固定液孵育30min，然后加入抗IL－17－FITC(美國BD公司)和抗IL－22－PerCP(美國BD公司)進行細胞內細胞因子染色，室溫避光孵育30min，洗滌后加入含有4%多聚甲醛/PBS溶液固定，使用FACS Calibur流式細胞儀分析，CellQuest Pro軟件獲取細胞，FlowJo Version 8.4.2軟件分析結果。

統計學分析:所有數據均采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。首先采用Shapiro－Wilk檢驗對樣本的正態性進行分析，所有樣本均符合正態分布。計量資料采用珋x±s表示，多組樣本間資料比較首先采用單因素方差分析，若存在差異再采用LSD－t檢驗進行兩兩比較，DAPT刺激前后的資料比較采用配對樣本t檢驗，采用Pearson相關性分析對兩組資料進行相關性檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VKH綜合征患者CD4+T細胞中Notch受體mRNA相對表達量和蛋白表達的變化 健康對照、靜止期VKH綜合征和活動期VKH綜合征患者間CD4+T細胞中Notch1 mRNA(F=238.8，P＜0.001)、Notch2 mRNA(F=183.7，P＜0.001)和 Notch3 mRNA(F=130.9，P＜0.001)的差異具有統計學意義。活動期VKH綜合征患者CD4+T細胞中Notch1、Notch2和Notch3 mRNA相對表達量較靜止期VKH綜合征患者和健康對照均顯著升高(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對照之間的差異無統計學意義(P=0.313、0.162、0.376)。CD4+T細胞中Notch4 mRNA相對表達量在三組之間的差異無統計學意義(F=0.362，P=0.698)，見圖 1。

圖1 實時定量PCR檢測健康對照和VKH綜合征患者Notch受體mRNA的表達 A:Notch1;B:Notch2;C:Notch3;D:Notch4;bP＜0.001 vs健康對照和靜止期VKH。

進一步檢測了 Notch1、Notch2、Notch3和 Notch4蛋白在6例活動性VKH綜合征患者和5例健康對照志愿者CD4+T細胞中的水平。與mRNA相對表達量的趨勢相似，VKH綜合征患者 CD4+T細胞中 Notch1、Notch2和Notch3蛋白水平顯著高于健康對照，而Notch4蛋白水平在兩組之間無顯著差異(圖2)。

2.2 VKH綜合征患者血漿IL－22、CD4+T細胞中AhR和RORγt轉錄因子以及Th17、Th22細胞的變化 血漿IL－22在健康對照、靜止期VKH綜合征和活動期VKH綜合征患者之間的差異有統計學意義(F=101.6，P＜0.001，圖3)。活動期 VKH綜合征患者血漿 IL－22(304.2±59.23pg/mL)顯著高于靜止期VKH綜合征患者(133.4±19.89pg/mL)和健康對照(140.2±23.47pg/mL)，差異均有統計學意義(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對照之間的差異無統計學意義(P=0.388)，且血漿IL－22水平與Notch受體mRNA相對表達量無顯著相關(P＞0.05)。健康對照、靜止期VKH綜合征和活動期VKH綜合征患者間CD4+T細胞中Th22細胞轉錄因子AhR mRNA(F=224.2，P＜0.001)和 Th17細胞轉錄因子RORγt mRNA(F=99.12，P＜0.001)的差異具有統計學意義，見圖4。活動期VKH綜合征患者CD4+T細胞中AhR和RORγt mRNA相對表達量較靜止期VKH綜合征患者和健康對照均顯著升高(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對照之間的差異無統計學意義(P=0.234、0.242)。Th22細胞和Th17細胞的流式檢測分析見圖5。健康對照、靜止期VKH綜合征和活動期VKH綜合征患者Th22細胞(F=18.76，P＜0.001)和Th17細胞(F=22.04，P＜0.001)比例的差異具有統計學意義。活動期VKH綜合征患者CD4+T細胞中Th22(3.38%±0.78%)和Th17細胞(5.51%±1.14%)比例較靜止期VKH綜合征患者(Th22:2.03%±0.63%;Th17:3.73%±0.86%)和健康對照(Th22:1.94%±0.81%;Th17:3.38%±0.72%)均顯著升高(均P＜0.001)，但在靜止期VKH綜合征患者和健康對照之間的差異無統計學意義(P=0.725、0.236)。

圖2 Western blot檢測健康對照和活性期VKH綜合征患者Notch受體蛋白的表達。

2.3 抑制Notch信號通路對活動性VKH綜合征患者CD4+T細胞轉錄因子表達和分泌IL－22的影響 取106個從活動性VKH綜合征患者分選的CD4+T細胞，加入DAPT刺激后，Notch信號通路下游分子Hes1和Hes5的表達顯著降低(圖6A)，提示DAPT有效抑制了Notch信號通路。AhR mRNA相對表達量顯著降低(t=7.088，P＜0.001，圖6B)，但RORγt mRNA相對表達量在無DAPT刺激和DAPT刺激的CD4+T細胞中的差異無統計學意義(t=1.247，P=0.233，圖 6C)。DAPT刺激后 CD4+T細胞分泌IL－22的水平亦顯著降低(44.47±11.83pg/mL vs 78.87±9.63pg/mL;t=8.472，P＜0.001，圖 6D)。

3 討論

雖然VKH綜合征的發病機制尚未完全闡明，目前的研究均認為VKH綜合征是機體攻擊靶器官中的黑色素相關抗原所致的自身免疫性疾病。研究發現，VKH綜合征的發病與人類白細胞抗原等位基因的多態性、IL－23受體的表達、固有免疫和適應性免疫功能失調以及環境誘導的免疫失衡等多種免疫因素相關［9－11］。

圖3 ELISA檢測健康對照和VKH綜合征患者血漿IL－22的表達 bP＜0.001 vs健康對照和靜止期VKH。

圖5 流式細胞術檢測健康對照和VKH綜合征患者Th22和Th17細胞比例 A:流式檢測散點圖;B:Th22;C:Th17;bP＜0.001 vs健康對照和靜止期VKH。

Notch信號通路是一種高度保守的細胞信號通路，可影響細胞形態和功能發育的多個過程，如多能祖細胞的分化、細胞增殖和凋亡等［12］。Notch信號通路在眼部血管系統發育中發揮重要作用，參與多種與血管生成相關的眼病(如視網膜新生血管疾病、脈絡膜新生血管疾病)的發生發展［13］。新近的研究發現，Notch1信號通路在氧誘導的視網膜血管退化中亦發揮調控作用［14］。但目前尚無Notch信號通路在VKH綜合征發病中的相關研究報道。本研究發現，Notch1、Notch2和Notch3 mRNA和蛋白在活動性VKH綜合征CD4+T細胞中的表達顯著升高，但在靜止期VKH綜合征患者中的表達則無明顯變化，提示Notch信號通路不但參與了VKH綜合征疾病的炎癥活動，還說明抑制機體免疫應答可能降低了Notch受體的表達。雖然僅有Notch1、Notch2和Notch3的表達升高，Notch4的表達無顯著變化，而根據實時定量PCR和Western blot結果，提示Notch2受體占優勢。但Notch1～4介導的下游信號通路是相同的，因此Notch1、Notch2和Notch3的表達升高已足夠誘導下游信號分子的活化。但由于Notch信號通路具有重要且廣泛的免疫應答調控功能，其在VKH綜合征發生發展中的免疫調控機制尚待深入研究。

圖6 DAPT刺激對活動性VKH綜合征患者CD4+T細胞中Notch下游信號分子表達和AhR、RORγt mRNA及分泌IL－22的影響A:Hes1和Hes5蛋白表達;B:AhR mRNA;C:RORγt mRNA;D:IL－22分泌;bP＜0.001 vs無DAPT刺激。

IL－22是一種具有雙重功能的細胞因子，其發揮促進炎癥應答或發揮免疫保護的功能取決于疾病類型、病期以及 IL－22 所處的免疫微環境等［15］。在活動性鞏膜炎［16］、自身免疫性非感染性葡萄膜炎［17］、干眼癥［18］患者的外周血或淚液中，IL－22的表達水平顯著升高;但在增生性糖尿病視網膜病變患者的房水中，IL－22的水平卻未見明顯變化［19］。但尚未見有關IL－22在VKH綜合征患者中的相關報道。本研究發現，活動期VKH綜合征患者血漿IL－22、Th17和Th22細胞的水平顯著升高，但靜止期VKH綜合征患者IL－22、Th17和Th22細胞的水平與健康對照比較則無明顯變化，提示IL－22不但參與了VKH綜合征患者的機體炎癥應答。還說明抑制機體免疫應答可能降低了IL－22的分泌。CD4+T細胞分泌IL－22主要由Notch信號通路調控，Th22細胞轉錄因子AhR參與了此過程，Notch－AhR－IL－22信號通路具有精細調控炎癥應答作用［4］。因此，雖然本研究在活動性VKH綜合征患者中未發現Notch受體與 IL－22表達存在明顯相關，但應用DAPT抑制Notch信號通路卻顯著降低IL－22的表達，在此過程中，Th22細胞轉錄因子AhR表達降低，而Th17細胞轉錄因子RORγt的表達未受明顯影響，提示Notch信號通路可能主要影響Th22細胞分泌IL－22，而對Th17細胞分泌IL－22的功能無顯著影響，這與在慢性病毒性肝炎［5－6］、肺癌［20］中的研究結果一致。由于既往的研究發現，IL－23受體和Th17細胞在VKH綜合征中的水平均升高，促進了 VKH 綜合征的疾病進展［11，21］。IL－23 主要作用于Th17細胞，促進Th17細胞產生IL－17和IL－22等細胞因子。因此，作為Th17細胞分泌的另外一種重要細胞因子，IL－22在VKH綜合征中很可能發揮促進炎癥應答、誘導疾病進展的作用，而這一功能仍有待體內試驗進一步證實。

總之，Notch－AhR－IL－22信號通路可調控VKH綜合征的炎癥應答，參與了VKH綜合征的發病，促進VKH綜合征的疾病進展。Notch信號通路及IL－22的調控可能作為治療靶點，為VKH綜合征的治療提供新的思路。