NLRP3炎癥復合體與原發性青光眼視神經損傷程度相關性

牟 琳，李 來，李 妍

作者單位:(646000)中國四川省瀘州市，西南醫科大學附屬中醫醫院眼科

0 引言

原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是最常見青光眼類型，約占青光眼60%～70%，因對患者的視覺功能造成嚴重影響，常顯著降低患者生活質量。POAG的病理特征是慢性進行性前部視神經病變，熱休克蛋白抗體升高為其特征之一，故有研究認為免疫因素在青光眼發生、發展中發揮重要作用，進而推測血清細胞因子所參與的免疫反應在青光眼進程中具有重要作用，且可能對疾病具有預測作用［1－2］。因此，本研究對POAG患者不同視神經損傷階段的血液巨噬細胞NOD樣受體蛋白3(nod－like receptor protein 3，NLRP3)炎癥復合體的表達進行檢測與比較，旨在進一步探究免疫反應在POAG中的作用，為臨床POAG診療提供理論參考。

表1 兩組患者IL－1β、IL－18濃度和NLRP3炎癥復合體的變化

表1 兩組患者IL－1β、IL－18濃度和NLRP3炎癥復合體的變化

注:對照組:白內障患者。

組別 例數 IL－1β (pg/mL) IL－18(pg/mL) NLRP3(%) ASC(%) Caspase－1(%)POAG 組 65 45.87±6.20 116.53±11.84 45.67±9.33 34.98±9.02 42.74±8.25對照組 30 19.05±8.13 95.43±15.92 36.32±8.96 28.15±9.17 38.08±6.51 t 17.712 7.216 4.596 3.413 3.122 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.001 0.002

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016－05/2017－05我院收治并確診的POAG患者65例98眼，其中男35例51眼，女30例47眼，年齡45～70(54.15±6.32)歲;正常眼壓性15例22眼，慢性單純性50例76眼。同時納入同期于本院診治的30例49眼白內障患者設為對照組，其中男13例23眼，女17例26眼，年齡43～72(53.27±6.74)歲。兩組患者的年齡、性別比例等資料比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。由經驗較豐富的醫師采用一體化全自動電腦視野儀對觀察組65例98眼POAG患者的視野平均缺損(mean defect，MD)程度進行檢測，根據MD值將觀察組分為輕度損傷組(A組)35例、中度損傷組(B組)16例及重度損傷組(C組)14例，MD值分別為≤6dB、7～12dB、＞12dB。三組患者的年齡、性別、眼壓等資料比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。納入標準:(1)結合患者資料，經兩位主治及以上醫師依據2008年專家共識診斷為POAG［3］;(2)有可供檢測的血漿標本。排除標準:(1)既往眼部手術史，或有接受放療、化療和生物細胞免疫治療病史的患者;(2)存在意識或精神障礙，不能配合的患者;(3)合并嚴重心、肝、腎等其他器官功能障礙或全身免疫性疾病患者;(4)合并血液性、感染性、免疫性疾病或其他惡性腫瘤疾病的患者。患者和家屬對研究內容知情，自愿參與并簽署知情同意書，研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 血清IL－1、IL－18水平檢測 對兩組患者的白細胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)、IL－18 血清細胞因子濃度進行檢測。具體檢測方法:抽取5mL外周靜脈血液標本，高速離心分離血清后，保存于－80℃冰箱中待測。采用雙抗體夾心酶聯免疫測定法(ELISA)檢測血清IL－1β、IL－18濃度，具體操作步驟嚴格按照說明書執行，ELISA檢測試劑盒購買于聯科生物有限公司。

1.2.2 血液巨噬細胞NLRP3炎癥復合體檢測 收集不同組別患者血液標本，分離提取白細胞，PBS洗滌細胞兩次，5%多聚甲醛室溫固定細胞30min，10%山羊血清室溫封閉1h，然后兔抗人 NLRP3、凋亡相關微粒蛋白(apoptosisassociated speck－like protein containing CARD，ASC)、胱冬肽酶－1(Caspase－1)一抗4℃孵育過夜，次日TBST洗滌細胞3次，PE－texas Red A標記的抗兔二抗室溫孵育30min，PBST洗滌細胞3次，雙蒸水重懸細胞，轉入流式管，BD LSR Fortessa流式細胞儀篩選出巨噬細胞亞群，進一步檢測細胞表面NLRP3、ASC、Caspase－1熒光強度，軟件分析并繪圖。

統計學分析:采用SPSS20.0軟件進行數據分析。計量資料以珋x±s表示，行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊，組間比較應用單因素方差分析，若差異有統計學意義，進行兩兩比較時采用Dunnet－t檢驗;兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。若差異無統計學意義，則不進行兩兩比較。計數資料采用率(%)表示，應用χ2檢驗分析;對 IL－1、IL－18濃度和 NLRP3炎癥復合體與POAG視野損傷程度的相關性采用Spearman相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 POAG組與對照組 IL－1β、IL－18濃度和 NLRP3炎癥復合體比較 POAG組IL－1β、IL－18濃度顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。進一步比較NLRP3炎性復合體陽性巨噬細胞比例，可見POAG組NLRP3、ASC、Caspase－1陽性細胞比例顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05，表 1)。

2.2 POAG組不同視野損傷患者 IL－1β、IL－18濃度和NLRP3炎癥復合體比較 A組、B組、C組之間的IL－1β、IL－18對比，差異均有統計學意義(P＜0.05)。進行兩兩比較，B組及C組的血清中IL－1β、IL－18的水平高于A組，差異均有統計學意義(均P＜0.05);C組血清中的IL－1β、IL－18水平高于 B組，差異均有統計學意義(均 P＜0.05)。A 組、B 組、C 組之間的 NLRP3、ASC、Caspase－1對比，差異有統計學意義(P＜0.05)。進行兩兩比較，B組及C組血液中NLRP3、ASC、Caspase－1陽性細胞比例均高于A組，差異均有統計學意義(均P＜0.05);C組血液中的NLRP3、ASC、Caspase－1陽性細胞比例的水平高于B組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 IL－1β、IL－18濃度及 NLRP3炎癥復合體與 POAG視野損傷相關性分析 POAG患者血清中IL－1β、IL－18的濃度水平與視野損傷程度呈正相關(r=0.432、0.765，均 P＜0.05)。POAG 患者 NLRP3、ASC、Caspase－1的陽性細胞比例與視野損傷程度呈正相關(r=0.517、0.481、0.340，均 P＜0.05)。

3 討論

NLRP3炎性復合體是由 NLRP3、ASC、Caspase－1 組成的高分子蛋白復合物，在多種免疫細胞中均有表達，在血液循環中NLRP3炎性復合體在巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞中均有表達［4］。目前認為，Toll樣受體 4(toll－like receptor 4，TLR4)等受體激活促進NLRP3炎癥復合體的表達，是啟動細胞炎癥性死亡的第一信號途徑。NLRP3炎癥復合體形成后，經K+內流、ROS產生等第二信號途徑激活，使 Caspase－1裂解成活性形式，最終促進 IL－1β、IL－18的成熟［5］。

表2 不同視野損傷患者IL－1β、IL－18濃度和NLRP3炎癥復合體的變化

表2 不同視野損傷患者IL－1β、IL－18濃度和NLRP3炎癥復合體的變化

注:A組:輕度損傷組;B組:中度損傷組;C組:重度損傷組。aP＜0.05 vs A組;cP＜0.05 vs B組。

組別 例數 IL－1β (pg/mL) IL－18(pg/mL) NLRP3(%) ASC(%) Caspase－1(%)A 組 35 39.48±7.97 118.07±13.92 40.22±8.79 32.25±10.16 39.76±6.18 B 組 16 43.37±6.22a 125.66±18.19a 46.39±9.09a 37.99±9.24a 43.66±7.82a C 組 14 47.65±8.73a，c 131.14±15.73a，c 51.12±10.73a，c 42.95±8.71a，c 49.39±8.05a，c F 5.79 3.96 7.52 6.61 9.56 P 0.005 0.024 0.001 0.003 ＜0.001

目前關于POAG的視神經損害機制仍有爭議，多種機制可能均與POAG導致的視神經損害密切相關，其可能的機制包括機械損傷、神經毒性作用和免疫反應等多種復合作用的結果。無論何種機制導致的視神經損傷，視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的凋亡是引起損傷的共同最終途徑。動物實驗模型研究發現，如IL－2R、IL－6、IL－10等多種炎癥抑制細胞因子對RGCs具有保護或者損傷作用，而IL－1β、IL－18炎癥因子對RGCs的作用以及在POAG中導致的視神經損害的關系仍缺乏相關報道［6－7］。因此，我們推測促進 IL－1β、IL－18 成熟的 NLRP3炎性復合體可能與POAG導致的視神經損害密切相關，對RGCs的凋亡起到一定的促進作用。

在血液循環中，IL－1β、IL－18的表達情況和 NLRP3炎癥復合體的形成與激活密切相關［8］。由于免疫因素在POAG中的作用，因此探究NLRP3炎癥復合體各個組分表達的第一信號途徑亦具有重要意義。研究表明，NLRP3炎癥復合體與急性肺損傷、阿爾茨海默病、缺血性腦梗塞等多種疾病的發生發展密切相關［9］。但是，目前NLRP3炎癥復合體在POAG中的作用仍缺乏相關報道。Wang等報道，IL－1β表達增加是POAG的重要危險因素，與視神經損傷密切相關［10］。但是，NLRP3炎癥復合體以及 IL－18在POAG中的作用仍不明確。通過我們的研究發現，POAG患者中IL－1β、IL－18顯著高于對照組，推測POAG可能存在NLRP3炎性復合體的過度激活。因此，我們進一步檢測了血液中NLRP3炎性復合體激活的比例，發現POAG患者中NLRP3、ASC、Caspase－1陽性細胞比例明顯高于對照組。

進一步研究POAG患者血清IL－1β、IL－18與視野損傷的相關性，發現青光眼患者血清中IL－1β、IL－18水平與視野損傷呈正相關，同時青光眼患者 NLRP3、ASC、Caspase－1陽性巨噬細胞比例與視野損傷亦呈正相關。

綜上，本研究表明POAG患者不同視神經損傷階段的血液巨噬細胞NLRP3炎癥復合體的表達差異明顯，視神經損傷越重，血清 IL－1β、IL－18 濃度越高，NLRP3、ASC、Caspase－1 陽性巨噬細胞比例越大，NLRP3、ASC、Caspase－1陽性巨噬細胞比例與視野損傷呈正相關。