黃曲霉毒素分解酶基因克隆及其在大腸桿菌中的融合表達

李 旺 史敦勝 丁 軻 曹平華 趙龍妹

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471023)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是一類化學結構類似的劇毒物質[1]，主要由曲霉菌屬的黃曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌在一定的環境條件下生物合成的次級代謝產物[2-3]，具有強烈的致畸、致癌和致突變作用[4-5]。AFT是各種糧食、食品和飼料中廣泛存在的一類霉菌毒素，對全世界人類和動物的健康構成極大的威脅[6-8]。近年來微生物及其產生的分解酶對AFT進行生物抑制和降解的方法陸續被報道，其中黃曲霉毒素分解酶(Aflatoxin-detofizyme，ADTZ)是特異性分解黃曲霉毒素的活性物質[9-12]。但天然黃曲霉毒素分解酶，難以從菌株中分離，不同微生物菌種對AFT的降解作用機理還不明確，酶的活性不高，大部分對標準品黃曲霉毒素B1(AFB1)具有分解效果[9,13]，而所篩選的酶對天然谷物等感染的黃曲霉毒素分解研究甚少。利用分子生物學和基因工程技術將ADTZ基因克隆，并在異源宿主中進行表達，可以獲得明確的分解酶產物，提高ADTZ的產量和活性[14]。

本研究擬通過已報道[15]的ADTZ序列合成引物，擴增ADTZ基因，在大腸桿菌中融合表達，驗證ADTZ基因是否可以進行異源表達，同時檢測表達產物表達量并應用到對谷物中黃曲霉毒素的分解上，以期獲得更高活性的ADTZ，對天然谷物中黃曲霉毒素的生物降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒菌種

質粒pGEM-Teasy：美國Promega公司；

質粒pMAL-c5x、大腸桿菌Rosetta(DE3)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

大腸桿菌(E.coliDH5ɑ)：本實驗室保存；

混合菌種混懸液：本實驗經發霉玉米制備，用以擴增ADTZ目的基因。

1.1.2 主要試劑

質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marker：天根生化科技(北京)有限公司；

黃曲霉毒素B1ELISA檢測試劑盒：北京華安麥科生物技術有限公司；

非預染蛋白Marker、預染蛋白Marker：生工生物工程(上海)股份有限公司；

NcoI、BamHI、DNA聚合酶(500 U)、DNA連接酶(100 U)：美國Promega公司。

1.1.3 主要設備

恒溫培養箱：DNP-9272BS型，上海新苗醫療器械制造有限公司；

恒溫培養搖床：SKY-2102型，上海蘇坤實業有限公司；

冷凍離心機：Thermo Micro 21R型，美國Thermo Electron Corporation公司；

電泳儀：JY600C型，北京君意東方電泳設備有限公司；

凝膠成像系統：Tanon 4600SF型，上海天能科技有限公司；

酶標儀：DNM-9606型，北京普朗新技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混合菌種混懸液制備 稱取200 g發霉玉米，破碎后置于500 mL燒杯中，加入20 mL蒸餾水，用塑料袋封住燒杯口，室溫條件下放置14 d，待霉菌菌絲長出，取表面10 g發霉玉米，加入30 mL的蒸餾水，用渦旋震蕩器震蕩5 min，經3層紗布過濾雜質，取180 μL的濾液沸水浴5 min后，加入20 μL的溶菌酶，在37 ℃水浴30 min。

1.2.2 目的基因的TA克隆與鑒定 以處理過的發霉玉米混合菌液為模板，利用表1中合成的引物(上游引物含NcoI酶切位點，下游引物含BamH I酶切位點)，55 ℃退火溫度擴增ADTZ基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收PCR產物。將回收的PCR產物與pGEM-Teasy載體連接，轉化到E.coliDH5α中，對重組菌進行培養，提取質粒命名pGEM-Teasy-ADTZ，并用NcoI、BamH I進行雙酶切鑒定。序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 目的基因引物信息Table 1 The primers of objective gene

1.2.3 表達載體的構建與鑒定 分別對重組質粒pGEM-Teasy-ADTZ、質粒PMAL-c5x用NcoI、BamH I進行雙酶切，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。用T4DNA連接酶連接、轉化到感受態細胞Rosetta(DE3)中，涂板在培養皿上形成單菌落。挑取陽性克隆菌落，提取質粒，對重組質粒進行酶切和測序，將重組的質粒命名為pMAL-c5x-ADTZ。

1.2.4 ADTZ基因的誘導表達及分析 挑取含pMAL-c5x-ADTZ質粒的Rosetta(DE3)菌落于含10 mL的LB培養基的大試管中，37 ℃，220 r/min搖床過夜擴大培養；將培養的菌液按體積比1∶100比例分別接種于8個裝液100 mL LB培養基的500 mL三角瓶中，添加Amp(1 μg/mL)溶液，37 ℃，220 r/min振蕩培養約2 h，當菌液OD值達到0.6～0.8時，在4個搖瓶中分別添加終濃度為1 mmol/mL的IPTG，并將4個三角瓶分2組，2瓶于25 ℃，220 r/min振搖誘導過夜；另2瓶于37 ℃，220 r/min 振搖誘導4 h。未加IPTG誘導培養的4個搖瓶菌種按照同樣的接種流程分別在25，37 ℃培養。對所有菌液進行低溫離心收集菌體和上清液，菌體進行超聲波破碎，然后將破碎的菌體和上清液分別進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 ADTZ粗酶液降解玉米AFB1試驗

(1)粗酶液的制備：將含pMAL-c5x-ADTZ質粒的Rosetta(DE3)菌液活化，加入IPTG，220 r/min，37 ℃誘導過夜培養；離心收集菌體，用10倍PBS緩沖液重懸超聲波破碎后，即為粗酶液。

(2)降解試驗：稱取5 g發霉玉米樣品置于25 mL的小燒杯中，121 ℃滅菌20 min。取5 mL的ADTZ粗酶液，加入到發霉的玉米樣品中，攪拌均勻，在37 ℃水浴鍋中反應48 h，在65 ℃條件下烘干樣品備測。對照組將ADTZ粗酶液煮沸滅活，同樣操作，對照組和試驗組各3個重復樣品。

(3)黃曲霉毒素檢測：取樣品5 g，加入60%甲醇25 mL 萃取AFB1；3 000 r/min離心10 min，取上清 1 mL 萃取液，再加入4 mL去離子水，稀釋至甲醇濃度12%的待測液(樣品共稀釋25倍)。按照ELISA 檢測試劑盒說明書操作方法測定樣品AFB1的含量。按式(1)計算AFB1降解率。

(1)

式中：

d——降解率，%；

c——對照組AFB1含量，μg/kg；

t——試驗組AFB1含量，μg/kg。

2 結果與分析

2.1 ADTZ序列的克隆與序列分析

以發霉玉米提取的混合菌液為模板，對ADTZ序列進行PCR擴增，凝膠電泳結果顯示成功擴出了大于2 100 bp 大小目的的條帶，如圖1(a)泳道1、2、3。將PCR擴增產物與pGEM-Teasy進行連接，提取重組質粒，命名為pGEM-Teasy-ADTZ，對其進行NcoI、BamH I雙酶切鑒定，酶切后獲得兩條目的條帶，其中一條約為3 000 bp，另一條約為2 100 bp，與PCR擴增結果和載體大小一致，如圖1(b)所示。將質粒進行測序，結果表明該基因片段大小為2 088 bp，連續編碼695個氨基酸。在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網站上的BLAST比對，結果顯示，該基因與NCBI網站公布報道的黃曲霉毒素分解酶基因(gene ID:AY941095.1)序列[15]相似性達到99%(見圖2)，整個序列中有3處共9個堿基與已報道[15]的黃曲霉基因堿基不同，說明已成功從發霉玉米混懸菌液中克隆得到黃曲霉毒素分解酶基因。

圖1 ADTZ基因的PCR擴增和酶切鑒定Figure 1 PCR amplification and identification of the ADTZ sequence

已知的ADTZ基因來源于真菌假密環菌(Armillariellatabescens)[15]，但也有報道[9-12]表明，很多微生物具有降解黃曲霉毒素的能力。本試驗中ADTZ基因，是從發霉玉米中提取的混合菌液中擴增得到，且與黃曲霉毒素分解酶(ADTZ)基因序列相似性達到99%。結合李俊霞等[16]從發霉飼料中篩選出兩株降解AFB1菌株的試驗結果，推測發霉玉米中不僅含有能夠產生AFT的微生物，同時也具有能夠降解黃曲霉毒素的微生物的存在。其可能為較高濃度的毒素作為一種選擇壓力，能夠降解AFT菌株更容易生存。在模板不明確的條件下，從混合菌液中成功獲得ADTZ基因，表明PCR探針能夠有效地篩選出目的基因。與常規的PCR技術進行比較，利用菌液PCR技術篩選目的基因快速靈敏，成本較低，是獲得目的基因片段的有效途徑[17]。

方框內ADTZ堿基序列與已報道的黃曲霉基因(AY941095.1)堿基不同圖2 ADTZ序列分析與比對Figure 2 Analysis and alignment of ADTZ sequences

2.2 重組質粒pMAL-c5x-ADTZ的構建與鑒定

ADTZ基因片段經NcoI、BamH I雙酶切后連接、轉化，構建重組質粒pMAL-c5x-ADTZ，該質粒的各序列結構圖譜如圖3所示。

挑取含有pMAL-c5x-ADTZ重組質粒的陽性菌，擴大培養后提質粒，用限制性內切酶NcoI、BamH I雙酶切鑒定，結果如圖4所示。質粒酶切后獲得兩條DNA片段，其中一條與載體大小一致，約為5 700 bp，另一條與ADTZ目的基因大小一致，約為2 100 bp，表明目的基因成功連接到大腸桿菌表達載體上。

2.3 ADTZ基因在大腸桿菌中的表達

將含有重組質粒pMAL-c5x-ADTZ的大腸桿菌Rosetta(DE3)和宿主菌在25，37 ℃下培養，收集菌體和上清，對菌體破碎后進行聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)，結果如圖5所示。

由圖5可知，在宿主大腸桿菌Rosetta(DE3)菌體蛋白中未出現于目的蛋白大小相當的條帶。在重組大腸桿菌的上清液和菌體蛋白中(泳道2～4)均可檢測到分子量約116 kDa 的蛋白條帶，與MBP標簽和ADTZ蛋白兩者融合產生的蛋白分子量一致。其中菌體中的目的蛋白含量更多，37 ℃培養的細菌菌體中目的蛋白含量高于25 ℃培養，而上清液中目的蛋白含量相反。

圖3 重組質粒pMAL-c5x-ADTZ模式圖Figure 3 Schematic diagram of the recombinant plasmid pMAL-c5x-ADTZ

DNA分子標量從上到下依次為10 000，8 000，6 000，5 000，4 000，3 500，3 000，2 500，2 000，1 500，1 200，1 000，900，800，700，600，500，400，300 bp
圖4 質粒PMAL-c5x-ADTZ的雙酶切鑒定
Figure 4 Identification of plasmid PMAL-c5x-ADTZ by double digestion

M.Protein Marker 1.Rosetta(DE3)總蛋白 2.25 ℃上清 3.25 ℃沉淀 4.37 ℃上清 5.37 ℃沉淀圖5 MBP-ADTZ融合蛋白SDS-PAGE檢測Figure 5 MBP-ADTZ fusion protein SDS-PAGE detection

對重組大腸桿菌進行IPTG誘導表達結果如圖6所示。宿主Rosetta(DE3)誘導后無與目的蛋白大小一致的條帶出現；而其他4條泳道均有大小與目標蛋白一致的蛋白條帶，其規律未進行誘導的結果一致，表達的蛋白量高于未經誘導的菌株。進一步驗證了ADTZ基因能夠在大腸桿菌中與MBP標簽進行了融合并表達，表達產物大部分在細胞內，受誘導物的誘導。

pMALTM系統是一種高效的蛋白融合表達系統，其中pMAL 載體含有編碼麥芽糖結合蛋白(Maltose Binding Protein，MBP)的基因，其下游插入目的基因，可利用 MBP 標簽對麥芽糖的特異性，結合實現融合蛋白的一步親和純化[18]。其中MBP蛋白大小為40 kD，由大腸桿菌K12的malE基因編碼，具有表達效率高、蛋白穩定、易于純化等優點，能夠協助新生的多肽鏈折疊，并組裝成穩定的有生物活性的結構[19-20]。本試驗正是利用該表達系統的特點，進行ADTZ基因的融合表達，并獲得了具有生物活性的表達產物。驗證了該系統的可靠性。

M.預染Protein Marker 1.誘導前總蛋白 2.25 ℃上清 3.25 ℃沉淀 4.37 ℃上清 5.37 ℃沉淀圖6 MBP-ADTZ誘導表達電泳圖Figure 6 Induced expression electrophoresis of MBP-ADTZ

已報道[16,21]來源于假密環菌(Armillariellatabescens)的ADTZ基因，編碼合成的生物蛋白為假密環菌的胞內酶，具有降解AFT的能力，能獨立完整地表達具有活性的ADTZ蛋白，并能夠在大腸桿菌以及酵母菌(Pichiapastoris)中表達[22-23]。溫思霞等[15]通過分子克隆技術，成功克隆并重組表達了一種具有AFB1轉化功能的黃曲霉毒素氧化酶(Aflatoxin-oxidase，AFO)，同時試驗推測ADTZ酶可能存在于其他能夠降解AFT的生物菌株中。本試驗擴增的ADTZ基因與已有的報道，雖然同源性高達99%，但存在3處堿基的突變，通過構建表達載體pMAL-c5x實現了黃曲霉毒素在大腸桿菌中的異源融合表達，表達產物具有生物活性，豐富了AFB1降解基因的種類。

2.4 AFDZ表達產物對玉米AFB1的分解

為了驗證ADTZ基因表達產物——黃曲霉毒素分解酶的酶活性，用其對發霉玉米的AFB1進行分解試驗，結果如表2所示。對照組中AFB1測定結果平均值為27.97 μg/kg，試驗組中AFB1的平均值為6.24 μg/kg，AFB1平均降解率為77.69%。表明，ADTZ基因在大腸桿菌中的表達產物能夠有效地降低天然發霉樣品中的AFB1的含量，更進一步驗證了ADTZ基因結構完整，能夠實現異源表達，且表達產物具有生物學活性。

表2 表達產物對玉米AFB1的降解結果Table 2 Degradation of expressed products to maize AFB1

本試驗中重組菌粗酶液對黃曲霉毒素的降解率為77.69%，低于已報道的降解率(達到80%以上[24-25])。分析其原因可能：本試驗表達產物為融合蛋白，在降解功能上可能受到影響；本試驗測定的降解率為天然發霉玉米種的AFB1，與標準品AFB1比較，天然樣品的結構更復雜，降解其中的AFB1難度更高。

3 結論

采用PCR的方法成功從發霉玉米樣品中擴增到黃曲霉毒素分解酶基因，通過序列分析與已報道[15]的基因相似度達到99%，說明黃曲霉毒素分解酶基因廣泛存在于自然界的微生物菌種中，并豐富了黃曲霉毒素分解酶基因序列。通過構建表達載體實現了該基因在大腸桿菌中的表達，表達產物表現出了分解黃曲霉毒素的能力，說明可以通過異源表達獲得高純度的黃曲霉毒素分解酶。本研究使用大腸桿菌表達系統進行基因表達，后續的研究將集中在該基因產物的分離純化方面，以獲得純度較高的酶蛋白，并通過分子手段從基因水平對其進行改造以提高表達產物分解天然黃曲霉毒素的效果。