青海牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸組成分析

馮西婭 張 玉 索化夷 王洪偉

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400700；2.西南大學食品科學與工程國家級教學示范中心，重慶 400700)

牦牛乳脂肪中主要含有棕櫚酸(28%～34%)、油酸(21%～37%)和硬脂酸(9%～19%)[1]。相對于其他牛乳脂肪，牦牛乳脂肪中含有較高含量的功能性脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[2]。目前，中國關于牦牛乳的研究[3-4]多是針對其蛋白質特性及總脂肪酸組成，但對牦牛乳甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成未有研究。甘油三酯是由1個甘油分子和3個脂肪酸分子組成，脂肪酸在甘油三酯中的位置分布是影響脂肪營養的重要因素，決定著甘油三酯的吸收代謝及油脂的應用價值[5]。甘油三酯Sn-2位脂肪酸分析可以幫助研究人員有效地剖析其結構，對牦牛乳的利用及產品營養學功能分析具有一定的科學參考價值[6]。

本試驗擬通過胰脂肪酶對甘油三酯Sn-1，3位進行專一性水解，將Sn-1，3位置上的脂肪酸游離出來，經薄層層析分離得到甘油一酯[6]。再利用氣相色譜分析方法研究牦牛乳脂肪的Sn-2位脂肪酸組成，以期為牦牛乳的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牦牛乳脂肪：采自青海地區海拔2 000，2 500，3 000，3 500 m處的牧民家；

37種C4～C24脂肪酸甲酯混標：產品編號18919-1AMP | SUPELCO，美國Sigma-aldrich公司；

豬胰脂肪酶：3萬U/g，重慶市鈦新化工有限公司；

膽酸鈉、柱層析硅膠、氫氧化鉀、氯化鈣、甲醇、乙醚、石油醚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)：分析純，重慶市鈦新化工有限公司；

無水乙醚、石油醚：色譜純，重慶市鈦新化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜儀：GC-2010型，配備電子捕獲檢測器(ECD)及氫火焰離子化檢測器(FID)，日本島津公司；

超聲波清洗機：SB-3200DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

高效薄層層析硅膠板：GF254(20 cm×20 cm)型，北京貝洛生物科技有限公司；

硅膠柱：柱長30 cm，內徑2 cm，重慶市鈦新化工有限公司；

薄層色譜展開缸：200 mm×200 mm，上海信誼儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 牦牛乳脂肪甘油三酯的制備 采用硅膠柱分離法。硅膠30 g，用石油醚調成糊狀填充層析柱。取牦牛乳脂肪1 g，溶于15 mL三氯甲烷，加入層析柱，然后用300 mL洗脫液(石油醚—乙醚混合溶液，體積比9∶1)洗脫，流速1.0～1.5 mL/min。收集液用旋轉蒸發儀減壓除去溶劑，得純甘油三酯，供氣相色譜分析使用。

1.2.2 牦牛乳甘油三酯脂肪酸組成測定 根據文獻[7]，修改如下：取100 mg牦牛乳脂肪甘油三酯，裝入5 mL 離心管，加入石油醚—乙醚(體積比1∶1)混合溶液2 mL，適當振搖，40 ℃水浴40 min。再加氫氧化鉀—甲醇(0.4 moL/L)溶液1 mL混勻，40 ℃水浴靜置30 min。沿瓶壁加入1 mL蒸餾水，靜置，待分層后，吸取上清液并稀釋10倍利用氣相色譜儀檢測。

1.2.3 胰脂肪酶水解甘油三酯方法 根據文獻[8]，修改如下：稱取純化過的甘三酯0.1 g于50 mL離心管中，加入胰脂肪酶40 mg及Tris-HCl緩沖液(pH 8)4 mL，搖勻1 min；依次加入2 g/L的膽酸鈉溶液1 mL及220 g/L的CaCl2溶液0.4 mL，搖勻1 min；后置于40 ℃恒溫水浴鍋1 min 并不斷搖動；在40 ℃，18 kHz，80 W超聲波清洗機中超聲2 min，加入6 mol/L的鹽酸1 mL并搖勻，加入乙醚1 mL，搖勻，吸取上清液。經薄層層析分離，顯色確定甘一酯位置；刮取甘一酯，用乙醚提取后除去溶劑。

1.2.4 Sn-2位脂肪酸分析方法 對甘一酯進行甲酯化后經氣相色譜分析牦牛乳脂肪的Sn-2 位脂肪酸組成及含量。根據脂肪酸甲酯混合標準品的保留時間確定脂肪酸的組成成分，并用面積歸一法確定各組分的相對含量。

1.2.5 脂肪酸分布的測定或計算 以甘油三酯總脂肪酸和甘油三酯Sn-2位脂肪酸組成為基礎，通過式(1)計算一種脂肪酸結合在甘油三酯Sn-2位的含量占其總量的比例[9]。

(1)

式中：

c——脂肪酸結合在甘油三酯Sn-2位占比，%；

m1——甘油三酯Sn-2位脂肪酸含量，g；

m2——總脂肪酸含量，g。

1.3 數據處理

采用統計分析軟件SPSS對數據進行顯著性檢驗。每組試驗進行3次，結果用(平均值±標準偏差)表示。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳脂肪甘油三酯脂肪酸組成

將提純的牦牛乳甘油三酯甲酯化，然后進行氣相色譜分析，得到總離子色譜圖見圖1。所得圖譜結合37種脂肪酸甲酯標樣的保留時間比較分析定性，并采用峰面積歸一法定量，結果如表1所示。由表1可得：牦牛乳甘油三酯的脂肪酸種類共12種，中鏈飽和脂肪酸含量為2.18%～4.22%，飽和脂肪酸總量為63.44%～69.28%，顯著高于產自香格里拉地區及西藏拉薩地區的牦牛乳脂肪[1,10]。多不飽和脂肪酸含量為1.01%～2.34%，單不飽和脂肪酸含量為28.40%～34.21%，油酸(24.91%～30.99%)是含量最高的單不飽和脂肪酸。其次為棕櫚酸(31.35%～36.48%)和硬脂酸(9.82%～13.87%)。隨著海拔的升高，牦牛乳甘油三酯總脂肪酸中的SFA含量呈逐漸降低后升高的趨勢，UFA含量呈逐漸升高后降低的趨勢。海拔2 500 m處牦牛乳甘油三酯的棕櫚酸含量及LA/ALA(油酸/亞油酸)的比值顯著高于其他3個樣品，硬脂酸顯著低于其他3個樣品(P<0.05)。海拔3 000 m處牦牛乳甘油三酯的油酸含量顯著高于其他3個樣品(P<0.05)。

2.2 牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸組成

利用氣相色譜法分析牦牛乳脂肪甘油三酯Sn-2位脂肪酸組成，所得氣相色譜見圖2。得到牦牛乳脂肪Sn-2位不同脂肪酸含量，結果見表2。結合圖2及表2可知：牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸中含量較高的為棕櫚酸(39.91%～46.23%)和油酸(17.42%～20.81%)，十四烷酸(14.66%～20.68%)。不同海拔牦牛乳的Sn-2位棕櫚酸的含量之間均有顯著性差異(P<0.05)。海拔2 000 m處的Sn-2位棕櫚酸含量最高(46.23%)，顯著高于其他3個海拔處采集的樣品(P<0.05)。此外，青海地區牦牛乳Sn-2位棕櫚酸含量(39.91%～46.23%)顯著高于普通牛乳Sn-2 位棕櫚酸的含量(32.00%～ 34.74%)[11-12]。位于Sn-2位的棕櫚酸被體內的胰脂酶水解形成2-甘油一酯，與膽汁鹽形成乳糜微粒而被機體吸收，而Sn-1,3位置上的棕櫚酸被胰脂酶水解為游離脂肪酸，易與Ca2+形成鈣皂，不能被人體很好地吸收利用[13-15]。牦牛乳比普通牛乳更接近母乳中棕櫚酸的分布情況，更容易吸收，可為開發相關產品如配方奶粉等提供理論參考[16-17]。海拔2 000 m與海拔3 000 m的牦牛乳樣品均未檢出位于Sn-2位亞油酸與Sn-2位亞麻酸，而海拔2 500 m與3 500 m 處的牦牛乳樣品檢出少量。所有牦牛乳脂肪樣品的Sn-2位脂肪酸組成中均未檢出丁酸，說明丁酸絕大部分結合于Sn-1，3位上。結合2.1節的結果可知，不同海拔的牦牛乳脂肪甘油三酯的總脂肪酸之間及Sn-2位脂肪酸之間大多有顯著性差異，初步判斷是牦牛在高寒草甸自由放牧，不同海拔之間牧草組成不同，牧草的營養成分影響了牦牛乳脂肪的營養特性。

1.丁酸甲酯 2.己酸甲酯 3.癸酸甲酯 4.月桂酸甲酯 5.十四烷酸甲酯 6.十五烷酸甲酯 7.棕櫚酸甲酯 8.棕櫚油酸甲酯 9.硬脂酸甲酯 10.油酸甲酯 11.亞油酸甲酯 12.亞麻酸甲酯圖1 不同海拔牦牛乳的甘油三酯的脂肪酸組成Figure 1 Different altitude yak milk triglyceride fatty acid composition

表1 不同海拔牦牛乳的甘油三酯的脂肪酸組成及含量?Table 1 Fatty acid composition and content of triglyceride in yak milk at different elevations %

? 同行小寫字母不同表明具有顯著性差異(P<0.05)；MUFA：單不飽和脂肪酸，PUFA：多不飽和脂肪酸，UFA：不飽和脂肪酸，MCSFA：中鏈飽和脂肪酸，SFA：飽和脂肪酸。

1.己酸甲酯 2.癸酸甲酯 3.月桂酸甲酯 4.十四烷酸甲酯 5.十五烷酸甲酯 6.棕櫚酸甲酯 7.棕櫚油酸甲酯 8.硬脂酸甲酯 9.油酸甲酯 10.亞油酸甲酯 11.亞麻酸甲酯
圖2 不同海拔牦牛乳脂肪的甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成
Figure 2 Sn-2 fatty acid composition of triglyceride in four kinds of yak milk fat

表2 不同海拔牦牛乳脂肪的甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成及含量Table 2 Sn-2 Fatty acid composition and content of triglyceride in four kinds of yak milk fat %

? “-”表示含量很少或者未檢出；同行小寫字母不同表明具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 不同海拔牦牛乳脂肪酸在甘油三酯結構中的位置分布

如圖3所示，結合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的SFA占比達34.1%～40.0%，UFA的占比達21.8%～31.3%。結合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C14:0和C16:0占比分別達到了50.0%～62.5%和37.4%～47.5%，而 C18:0和 C18:1占比達到了16.1%～20.0%和19.6%～28.8%。隨著海拔的升高，結合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的SFA占比先逐漸升高，后顯著降低(P<0.05)。結合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C18:1、UFA占比呈先逐漸降低，趨于平緩后顯著升高的趨勢(P<0.05)。結合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C14:0占比先顯著性升高，后逐漸降低(P<0.05)。結合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C16:0、C18:0占比均是先顯著降低后顯著升高再顯著降低的趨勢(P<0.05)。

小寫字母不同表示不同海拔間差異顯著(P<0.05)圖3 不同海拔牦牛乳脂肪中主要脂肪酸結合在甘油三酯Sn-2位上的占比Figure 3 Proportion of various main fatty acids in yak milk fat at different altitudes in the Sn-2 position of triglyceride

3 結論

青海地區牦牛乳脂肪的脂肪酸種類共12種，其中飽和脂肪酸總量為63.44%～69.28%，含量最高的脂肪酸為棕櫚酸(31.35%～36.48%)。Sn-2位脂肪酸種類共檢測出9～11種，含量較高的為棕櫚酸(39.91%～46.23%)和油酸(17.42%～20.81%)，十四烷酸(14.66%～20.68%)。不同海拔的牦牛乳脂肪甘油三酯的總脂肪酸之間及Sn-2位脂肪酸之間大多有顯著性差異。青海地區牦牛乳脂肪中C14：0、C16:0、C15:0、C12：0、SFA主要結合在甘油三酯Sn-2位上，而C18:0、C18:1、C6:0、UFA主要結合在甘油三酯Sn-1,3位上。此外，青海地區牦牛乳Sn-2位棕櫚酸含量(39.91%～46.23%)顯著高于普通牛乳Sn-2位棕櫚酸的含量(32.00%～34.74%)，比普通牛乳更接近母乳中棕櫚酸的分布情況，更容易吸收，可為開發相關產品如配方奶粉等提供理論參考。

本研究明確了牦牛乳甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成及其分布情況。并對導致不同海拔Sn-2位脂肪酸組成有顯著性差異的原因進行了初步推斷——不同海拔生長的牧草不同，其營養成分影響了牦牛乳脂肪的營養特性。目前牦牛乳的營養學研究有待加強，明確了牦牛乳甘三的結構對于研究其營養學特性及牦牛乳制品的開發有促進作用。