軌道離子阱快速篩查及定量分析保健食品中73種非法添加成分

韓 智 龔 蕾 王會霞 朱曉玲 吳婉琴 劉國姣 王 彬

(1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；2.湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430070)

近年來，中國保健食品產業發展迅速，2018年全國保健食品市場產值達到4 000億元[1]。一些不法分子為獲取高額利潤在保健食品中非法添加化學藥物，以增強其宣稱的功效，可能導致消費者發生輕微中毒，嚴重的甚至危及生命[2]。據統計[1]，2017年7月～2018年5月查處的保健食品違法行為中，非法經營行為占全部案件總數高達45.19%，其中又以非法添加藥物為主。

為遏制保健食品中非法添加西藥的行為，在2018版《國家食品安全監督抽檢實施細則》[3]中，共有67種不同種類的非法添加西藥被列入日常監督抽檢范圍，涉及12種不同檢驗方法，但每種檢驗方法的檢測成分較少。保健食品非法添加西藥常用的檢測方法有薄層色譜法[4-6]、酶聯免疫法[7-8]、HPLC法[9-11]、GC-MS法[12-13]、HPLC-MS/MS[14-16]，HPLC-TOF-MS[17-20]等，這些方法的開發對保健食品中非法添加西藥監測提供很好的依據，但存在基質背景干擾問題。

靜電場軌道阱(Orbitrap)技術是由俄國科學家[21]根據靜電場軌道阱發展的新型質量分析器，具有高分辨率和高質量精度的特點，可實現食品中有毒有害物質或功效成分等物質的高通量篩查，已逐漸應用于保健食品檢測中。張曉光等[22]利用Q-Exactive Orbitrap篩查保健食品中23種降壓非法添加西藥成分，各藥物檢出限為0.2～0.5 μg/kg；劉蕓等[23]利用Q Exative Orbitrap對4類共31種保健食品進行42種非法添加西藥進行了篩查及定量測定，檢出限為1.0～10.0 ng/mL，檢出其中3種添加了非法藥物。

目前采用高分辨質譜對保健食品中非法添加物的篩查研究較少，且基本都是某一類或者幾類樣品單獨分析[22-23]，有必要建立一個高通量篩查方法，提高檢測效率。本試驗擬對73種保健食品中非法添加物作為研究對象，旨在建立一種簡單且快速的高通量定性篩查和準確定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保健食品：市售；

西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N-N-雙去甲基西布曲明等73種化學藥物標準品：純度≥95%，中國食品藥品檢定研究院；

乙腈：色譜級，德國Merck公司；

甲酸：色譜級，美國Thermo Fishers公司。

1.2 儀器與設備

高分辨液質聯用儀：Orbitrap Fusion型，美國Thermo Fisher公司；

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3型，100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters公司；

超純水器：Milli-Q型，法國密理博公司；

高速離心機：Avanti JXN-30型，美國Beckman Coulter公司；

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

數控超聲波清洗器：2600T型，上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 參考BJS 201710《保健食品中75種非法添加化學藥物的檢測》[24]，準確稱取1 g樣品，準確加入10 mL甲醇，渦旋混勻，超聲提取15 min，4 500 r/min 離心8 min，取上清液過濾膜，供Orbitrap Fusion高分辨液質聯用儀測定。

1.3.2 色譜條件優化

(1)色譜柱條件優化：比較了不同粒徑及長度的C18色譜柱，包括Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)，Thermo Accucore aQ(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)，Thermo Hypersill GOLD(2.1 mm×150 mm,3.0 μm)，Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)，發現Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)柱的峰形較好，對強極性物質保留好，峰形好，分離度高，因此本研究選用此色譜柱。

(2)流動相條件優化：比較了不同流動相及洗脫梯度對化合物的分離效果，最終確定流動相：A為乙腈；B為水(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，2% A；3.0～12.0 min，2%～95% A；12.0～15.0 min，95% A；15.0～15.1 min，95%～2% A；15.1～20.0 min，2% A。流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL。

1.3.3 質譜條件優化 本研究采用Full-scan ddMS2采集數據，為避免漏檢化合物，將目標母離子精確分子量預先輸入到目標離子框中，優先掃描指定m/z，達到設定閾值后觸發二級碎裂；利用四級桿隔離將m/z窗口設置為100～1 000，以減少其他雜質離子進入檢測器中。經過系列參數篩選后，儀器將選取符合條件且信號最強的母離子進行子離子掃描，使用Orbitrap質量分析器檢測子離子，由此得到高分辨數據。為了使分析物的數據質量達到最優，進行了分辨率、碰撞能量等參數的優化。優化后的參數如下：全掃描分辨率R=120 000、二級掃描分辨率R=60 000，自動增益控制目標離子數(AGC)為5×105，質量偏差窗口為5×10-6，高能碰撞裂解(HCD)碎裂能量為(45±15)%，離子源溫度325 ℃，離子傳輸桿溫度350 ℃，鞘氣265 kPa，輔助氣70 kPa。

2 結果分析

2.1 篩查方法建立

按照1.3的方法優化后，73種化合物的保留時間、母離子、碎片離子等信息見表1。在優化的質譜色譜條件下，73種化合物在20 min內都得較好的分離。盡管有一些化合物保留時間較為相同，如西布曲明和去甲基他達那非，保留時間同為8.54 min，但是質荷比有差異，使得很容易區分，見圖1。一些化合物為同分異構體，如偽伐地那非和那莫西地那非為同分異構體，質荷比相同，但是保留時間不一致，偽伐地那非保留時間為9.52 min，那莫西地那非為10.57 min，通過保留時間差異，也可進行準確定性分析，見圖2。

利用優化好的質譜條件采集標準品數據，采用Xcalibur軟件提取離子信息，用Trace Finder軟件建立數據庫，數據庫包含73種化合物的電離模式、母離子質量數、保留時間、二級特征碎片離子。

2.2 定性及定量

2018年，《食品中那非類物質的測定》食品補充檢驗方法的公告[25]指出，使用高分辨定性判定需要在試樣中檢出與某標準品色譜峰(或由標準品建立的譜庫)保留時間一致的色譜峰，并且與標準品母離子精確分子量誤差不超過5×10-6，主要碎片離子精確分子量誤差不超過10-5。從表1可以看出，本研究得到的數據庫內容能夠滿足高通量快速篩查定性的要求。定量方法采用外標法，將目標物母離子峰面積為縱坐標y，以目標物的濃度為橫坐標x，繪制標準曲線，根據待測物母離子峰面積進行定量計算。

圖1 西布曲明和去甲基他達那非提取離子流圖Figure 1 Extracted chromatograms of sibutramine and nortadalafil

表1 73種化合物參數Table 1 Parameters of 73 compounds

續表1

化合物名稱分子式保留時間掃描模式母離子(m/z)碎片離子(m/z)巴比妥C8H12N2O36.76[M-H]-183.07752140.0717,94.0662苯巴比妥C12H12N2O37.90[M-H]-231.07752188.0717,85.0044司可巴比妥C12H18N2O38.84[M-H]-237.12447194.1187,85.0044異戊巴比妥C11H18N2O38.59[M-H]-225.12447157.0608,111.1168氯美扎酮C11H12ClNO3S8.30[M+H]+274.02992154.0418,209.0602佐匹克隆C17H17ClN6O36.97[M+H]+389.11234245.0225,130.0053氯苯那敏C16H19ClN27.30[M+H]+275.13095230.0731,167.0730扎來普隆C17H15N5O8.54[M+H]+306.13494264.1244,236.0904文法拉辛C17H27NO27.47[M+H]+278.21146215.1430,121.0648青藤堿C19H23NO46.26[M+H]+330.16998181.0648,153.0700羅通定C21H25NO47.48[M+H]+356.18563165.0911,192.1018褪黑素C13H16N2O27.68[M+H]+233.12845174.0908,131.0726奧沙西泮C15H11ClN2O28.65[M+H]+287.05818241.0527,163.0058勞拉西泮C15H10Cl2N2O27.59[M+H]+321.01921289.0294,177.0214尼群地平C18H20N2O610.04[M-H]-359.12486226.0863,210.0913尼莫地平C21H26N2O710.22[M-H]-417.16672301.0819,255.0890尼索地平C20H24N2O610.41[M+H]+389.17073211.0850,183.0912非洛地平C18H19Cl2NO410.63[M-H]-382.06184278.0134,243.0445氫氯噻嗪C7H8ClN3O4S26.32[M-H]-295.95720204.9833,157.0162哌唑嗪C19H21N5O47.13[M+H]+384.16663247.1190,138.0550利血平C33H40N2O98.45[M+H]+609.28066448.1967,397.2122卡托普利C9H15NO3S7.10[M+H]+218.08454172.0792,116.0706可樂定C9H9Cl2N35.86[M+H]+230.02463212.9981,186.9824氨氯地平C20H25ClN2O58.13[M+H]+409.15248238.0629,294.0891硝苯地平C17H18N2O69.39[M+H]+347.12376315.0976,195.0917阿替洛爾C14H22N2O34.64[M+H]+267.17032190.0863,116.1070洛伐他汀C24H36O510.36[M+H]+405.26355199.1481,143.0855辛伐他汀C25H38O511.42[M+H]+419.27920199.1481,173.1325煙酸C6H5NO21.22[M+H]+124.0393078.0338,96.0444洛伐他汀羥酸鈉鹽C24H37NaO610.37[M-Na]-421.25956319.1902,101.0601美伐他汀C23H34O510.71[M+H]+391.24790155.0841,185.1316脫羥基洛伐他汀C24H34O411.90[M+H]+387.25299131.0862,199.1490那紅地那非C24H32N6O37.49[M+H]+453.26087297.1346,113.1073紅地那非C25H34N6O37.54[M+H]+467.27652297.1346,127.1230羥基豪莫西地那非C23H32N6O5S7.76[M+H]+505.2227799.0917,283.1190西地那非C22H30N6O4S7.80[M+H]+475.21220311.1503,283.1190氨基他達拉非C21H18N4O48.49[M+H]+391.14008269.1033,262.0863他達拉非C22H19N3O48.87[M+H]+390.14483268.1081,135.0441硫代艾地那非C23H32N6O3S28.75[M+H]+505.20501327.1274,299.0961,去甲基他達拉非C21H17N3O48.54[M+H]+376.12918302.0812,262.0862硫代西地那非C22H30N6O3S28.62[M+H]+491.18936100.0995,341.1424豪莫西地那非C23H32N6O4S7.85[M+H]+489.22785114.1152,311.1503伐地那非C23H32N6O4S7.42[M+H]+489.22785312.1581,151.0866偽伐地那非C22H29N5O4S9.54[M+H]+460.20130169.0974,312.1581那莫西地那非C22H29N5O4S10.55[M+H]+460.20130312.1581,283.1195

圖2 偽伐地那非和那莫西地那非提取離子流圖Figure 2 Extracted chromatograms of vardenafil and norneosildenafil

2.3 基質效應

基質效應由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現為離子增強或離子抑制作用，儀器的分辨率及抗干擾能力也影響基質效應，若有較強的基質增強或基質減弱效應的一般采取基質匹配標準曲線進行定量分析。Orbitrap具有超高分辨率，背景噪音干擾極小，基質效應相對較低。為了進一步明確保健食品中的基質效應，本研究驗證了片劑、膠囊、口服液的基質效應，均在80%～120%，因此定量時不考慮基質效應帶來的影響。

2.4 線性關系及檢出限

采用Orbitrap高分辨質譜對73種非法添加的西藥進行定量分析，以目標物母離子特征離子峰面積作為縱坐標y，以目標物的濃度為橫坐標x，繪制標準曲線，所有化合物在一定的范圍內線性關系良好，R>0.99。在空白片劑樣品中添加低濃度的目標化合物，檢出限(LOD)以S/N=3確定，S/N=10時對應濃度為定量限，各化合物的檢出限及定量限見表2。

表2 各化合物檢出限及定量限Table 2 The LOD and LOQ of 73 compounds

續表2

化合物名稱線性范圍/(ng·mL-1)R檢出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)化合物名稱線性范圍/(ng·mL-1)R檢出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)氯硝西泮0.6～2000.99926羥基豪莫西地那非0.6～2000.99826三唑侖0.6～2000.99926西地那非0.6～2000.99826地西泮0.6～2000.99926氨基他達拉非1.5～3000.999515巴比妥6.0～5000.9982060他達那非0.6～2000.99926苯巴比妥6.0～5000.9982060硫代艾地那非1.5～3000.999515司可巴比妥6.0～5000.9982060去甲基他達拉非0.6～2000.99926異戊巴比妥6.0～5000.9992060硫代西地那非1.5～3000.999515氯美扎酮1.5～3000.998515豪莫西地那非0.6～2000.99926佐匹克隆1.5～3000.999515伐地那非0.6～2000.99926氯苯那敏1.5～3000.998515偽伐地那非0.6～2000.99826扎來普隆1.5～3000.999515那莫西地那非1.5～3000.998515文法拉辛1.5～3000.998515

2.5 回收率及精密度

在膠囊、片劑、口服劑3種保健食品基質中按照100，500，1 000 μg/kg含量添加標準溶液，每個水平重復3次。經計算，其回收率為72.2%～117.5%，相對標準偏差為2.3%～6.8%，表明該方法是一種適合不同基質保健食品非法添加高通量快速篩查定量的方法。

2.6 實際樣品檢測

利用本方法對市售28份保健食品進行檢測，1批次檢出洛伐他汀，1批次檢出他達那非。

3 結論

本研究采用甲醇超聲提取，建立了保健食品中非法添加西藥成分高通量篩查及定量方法，該方法簡單、快速，精密度及準確性高，不僅可以作為快速篩查及定量73種化合物的方法，還可以根據檢測需求反復調用，進行其他目標化合物的靶向確證及非靶向篩查，擴寬了數據的可利用性，但本研究的非法添加藥物種類仍然有限，今后應不斷完善補充數據庫。