花生殼木犀草素蒸汽爆破預處理工藝優化及結構分析

趙鵬成 易軍鵬 李 欣 楊亞皇 賀 健

(1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學化工與制藥學院，河南 洛陽 471023)

花生(Arachishypogaea)亦名落花生，來源于豆科一年生草本油料植物，是人類重要的食用植物油資源[1]。中國是花生生產大國之一，2017年產量已達1 709.23萬t，花生殼按30%計算，其產量約500萬t[2-3]?；ㄉ鷼S酮組分的主要物質為木犀草素[4]，從黃酮類物質中分離得到的木犀草素在臨床上具有止咳、祛痰及消炎的作用[5-6]，在體內具有抗菌、抗病毒、抗癌以及降低血脂等作用[7-10]。因此以木犀草素為代表的花生殼中黃酮類化合物也受到空前的重視。

目前，黃酮的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲輔助提取技術、微波輔助法和酶輔助提取法[11-14]。傳統的提取方法存在得率較低的問題，微波輔助法和超聲波輔助法能耗和成本較高，酶輔助提取法操作繁瑣，不適于工業生產。蒸汽爆破(Steam Explosion Pre-treatment，SEP)常用于處理中草藥和動物飼料等[15-16]。木質原料在高溫、高壓蒸汽作用下，纖維素聚合度下降，半纖維素部分降解，木質素軟化，橫向連結強度下降。當充滿壓力蒸汽的物料瞬時(0.087 5 s)泄壓，孔隙中的水氣劇烈膨脹，產生“爆破”效果，可部分剝離木質素，并將原料撕裂為細小纖維，原料中的細胞壁和表層纖維被不同程度的打破，使目標成分從細胞內部溶出進入提取介質中。研究[17-19]表明，蒸汽爆破技術可以使原料提取率明顯提高，該預處理技術已廣泛應用于油脂、糧食和中草藥等行業。

本研究擬以花生殼為原料，以蒸汽爆破壓力、維壓時間、含水率等因素對木犀草素得率影響，通過響應面法優化蒸汽爆破預處理的最優工藝，并利用大孔吸附樹脂對木犀草素粗品進行純化，通過紫外分光光度法和紅外圖譜對純化后的木犀草素進行定量定性分析，為今后對花生殼木犀草素的更深入研究以及花生殼資源綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶殼花生：魯花11號，產地河南洛陽；

大孔吸附樹脂：AB-8型，東鴻化工有限公司；

木犀草素標品：96%，上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇、石油醚、鹽酸、氫氧化鈉、溴化鉀等：分析純，天津德恩化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

間歇式蒸汽爆破機：QBS-80型，鶴壁正道生物能源有限公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

分析天平：FA-1005型，上海儀器有限公司；

PH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

電子掃描顯微鏡：JSM-5610LV型，日本電子株式會社；

紫外可分光光度計：UV-4800型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

氣浴恒溫振蕩器：ZD-85型，常州金壇精達儀器制造有限公司；

傅里葉紅外變換光譜儀：TENSPOR27型，德國BRUKER儀器公司；

高效液相色譜儀：E2695型，美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 花生殼蒸汽爆破預處理 將花生殼清洗干凈，置于45 ℃烘箱內干燥24 h，將干燥的花生殼用等梯度比例的去離子浸泡12 h，放入QBS-80型蒸汽爆破機物料倉中，通入飽和蒸汽，選取不同梯度維壓時間和蒸汽爆破壓力，在微秒內(0.087 5 s)完成釋壓，預處理后的花生殼置于45 ℃干燥箱內干燥至恒重，裝密封袋后避光保存。

1.3.2 蒸汽爆破預處理工藝優化

(1)單因素試驗：根據文獻[20]可知，蒸汽爆破預處理對活性物質提取的主要影響因素為爆破壓強、維壓時間和含水率。因此本試驗對以上3個工藝參數分別設計5個梯度，通過控制變量法進行試驗。即爆破壓強因素選取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 MPa；維壓時間因素選取15，30，45，60，75 s；含水率因素選取5%，10%，15%，20%，25%。固定參數為爆破壓強1.2 MPa，含水率15%，維壓時間45 s，比較不同爆破條件對木犀草素提取率的影響。

(2)響應面試驗設計：通過單因素試驗，確定預原料含水率、蒸汽爆破壓力和維壓時間3個獨立變量，以木犀草素提取率為響應值，根據Box-Behnken試驗的設計原理，對花生殼汽蒸汽爆破參數采用三因素三水平響應面分析法進行試驗設計，建立數學模型，并對各因素間的相互作用，以及各因素與響應值之間的關系進行分析。單次試驗重復3次，試驗結果取平均值。

1.3.3 木犀草素標準曲線的繪制 精密稱取木犀草素標準品5 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，吸取木犀草素標準溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分別加70%乙醇定容至10 mL，混勻，利用紫外分光光度計測定352 nm處吸光度[21-23]。以吸光度值為縱坐標，木犀草素質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.165 8x+0.018 6(R2=0.999 8)。

1.3.4 花生殼木犀草素提取工藝 將未處理及蒸汽爆破預處理后的花生殼粉碎過60目篩。稱量花生殼粉末3 g，加入10倍體積的石油醚萃取脫脂3次。向脫脂后的花生殼粉末按1∶15(g/mL)加入70%乙醇，70 ℃回流提取1 h，抽濾得濾液[24]。殘渣按上述方法重復提取1次，合并兩次濾液作為提取液，取1/5提取液用70%乙醇稀釋30倍并測定其吸光度，結合木犀草素標準曲線，按式(1)進行木犀草素提取率測定。

(1)

式中：

S——木犀草素提取率，%；

c——木犀草素提取液濃度，mg/mL；

v——提取液體積，mL；

D——稀釋倍數；

m——花生殼粉末樣品質量，g。

1.3.5 木犀草素的純化 按1.3.3制備木犀草素提取液，置于50 ℃真空旋轉蒸發儀中，旋蒸至水浸膏，加入10倍量的去離子水進行洗滌，8 000 r/min離心取沉淀，并重復洗滌沉淀兩次。加入無水乙醇溶解沉淀物，離心取上清液，旋蒸至近干，加入70%乙醇30 mL進行洗滌，重復洗滌兩次，合并兩次洗滌液調整成pH為6的靜態吸附樣品液待用。

AB-8大孔吸附樹脂經無水乙醇、酸、堿預處理后，洗滌至中性[23]。稱取預處理好的AB-8濕樹脂20 g，裝入100 mL具塞錐形瓶中，加入60 mL樣品液，密封后放入搖床中25 ℃，150 r/min振搖6 h，取出靜置24 h，過濾取充分吸附后的樹脂進行動態解吸。將吸附后的樹脂進行濕法裝柱，用70%乙醇進行動態洗脫，流速2.0 BV/h，洗脫液總量200 mL。利用紫外分光光度計對洗脫液進行木犀草素含量測定。取1/2洗脫液置于50 ℃真空旋轉蒸發儀中，旋蒸至水浸膏，去離子水洗出并定容至20 mL，真空冷凍干燥成粉末，得木犀草素純化樣品，準確稱量樣品重量并計算木犀草素純度。剩余1/2洗脫液進行高效液相色譜定性分析。

1.3.6 花生殼微觀結構觀察 將干燥至恒重的花生殼樣品用導電膠帶粘到樣品臺上，用掃描電子顯微鏡分別觀察不同汽爆參數預處理和未經汽爆預處理的花生殼微觀結構的變化。

1.3.7 木犀草素紅外光譜分析 對木犀草素標準品、未處理的木犀草素樣品和汽爆處理的木犀草素樣品采用溴化鉀壓片法制樣。將溴化鉀粉末在紅外干燥箱內干燥，取2 mg木犀草素樣品與40 mg左右的溴化鉀粉末在研缽中充分研磨，使用壓片機制成薄片后在4 000～400 cm-1波長范圍內進行紅外光譜掃描，用不加樣品的溴化鉀薄片進行背景掃描。

1.3.8 花生殼木犀草素高效液相色譜分析 同時對純化后樣品進行高效液相檢測，色譜條件為：Diamonsil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-0.5%磷酸(70∶30，體積比)作為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，檢測波長352 nm。

1.4 數據分析

以上所有試驗重復3次，采用DPS 9.50數據處理軟件，對試驗結果進行單因素試驗統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 物料含水率對花生殼木犀草素得率的影響 由圖1 可知，控制維壓時間及蒸汽爆破壓強相同的條件下，木犀草素得率隨物料含水率提高先增加后降低，在含水率為15%條件下木犀草素得率達到最高。由于適當的水分能夠使物料充分溶脹，提高蒸汽滲透效率，進而增強蒸汽爆破效果，提高木犀草素得率。當物料水分過飽和，多余的水分占據物料內部間隙，阻礙蒸汽滲透，降低蒸汽爆破效果[25]。

2.1.2 爆破壓強及維壓時間對花生殼木犀草素得率的影響 由圖2、3可知，隨著蒸汽爆破壓力的升高和維壓時間的延長，花生殼木犀草素得率均呈先增加后減少趨勢，在蒸汽爆破壓強1.2 MPa及維壓時間45 s條件下木犀草素得率達到最高。這是由于黃酮成分大部分被包裹在細胞壁中[26]，隨著爆破強度的增強，有效地打破花生殼內部細胞壁的阻礙作用，促進其中的黃酮類物質提取率增加[27]。但當爆破壓力和維壓時間繼續增大和延長時，木犀草素提取率反而出現降低，與張琪等[28]蒸汽爆破預處理對粉葛總黃酮及抗氧化性的影響結果一致。由于在高溫高壓條件下可能會促使花生殼中活性成分發生化學變化，導致黃酮類物質發生降解，另外細胞內部溶出的黃酮類物質又重新聚合形成不溶性物質[29]，最終致使木犀草素提取率隨壓強和時間的變化先增后減。因此適當的爆破壓力和維壓時間可以對木犀草素得率起到促進作用。

圖1 含水率對木犀草素得率的影響
Figure 1 Effect of water content on the extraction yields of luteolin from peanut shell

圖2 爆破壓強對木犀草素得率的影響Figure 2 Effect of steam explosion pressure on the extraction yields of luteolin from peanut shell

圖3 維壓時間對木犀草素得率的影響Figure 3 Effects of residence time on the extraction yields of luteolin from peanut shell

2.2 響應面結果分析

2.2.1 試驗設計與結果分析 根據Box-Behnken試驗設計原理，通過響應面分析法對花生殼蒸汽爆破技術的提取工藝進行優化。試驗因素和水平見表1，響應面設計方案及結果見表2。

采用Design Expert分析軟件進行回歸擬合分析，分析得到多元二次回歸模型方程：

(2)

表1 Box-Behnken試驗因素和水平表Table 1 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Box-Behnken design with independent variables and response values

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance (ANOVA)for the regression model

2.2.2 試驗因素間的相互作用 為更直觀說明交互影響作用，對交互項作響應面圖和等高線圖。其中含水率和蒸汽爆破壓力的交互項呈現出典型的橢圓形(見圖4)，說明兩因素交互作用顯著。

圖4 含水率和爆破壓強對花生殼木犀草素得率的交互影響Figure 4 Interaction effects of water content and blasting pressure on yield of luteolin from peanut shell

2.2.3 最佳工藝參數優化 根據DPS 9.50軟件預測，得到蒸汽爆破工藝的最佳參數組合為蒸汽爆破壓力1.24 MPa，維壓時間 46.27 s，預浸泡含水率15.89%，在相同提取條件下，木犀草素得率為0.928%。考慮到現實操作性，蒸汽爆破工藝參數校正為蒸汽爆破壓力1.25 MPa，維壓時間46 s，預浸泡含水率16%，在此條件下木犀草素得率為0.926%，實際提取率與理論值接近，差異不顯著。未經爆破處理的花生殼在相同提取條件下木犀草素得率僅為0.472%。本試驗經過蒸汽爆破處理后的樣品，在相同提取條件下最終提取量高出未經爆破處理的樣品近1倍。說明該模型的擬合程度較好，校正后的蒸汽爆破參數準確可靠，具有一定實用價值。

2.3 蒸汽爆破對花生殼的微觀結構影響

圖5對比了未經汽爆處理和在蒸汽爆破壓力1.25 MPa，維壓時間46 s，預浸泡含水率16%的條件下處理的花生殼的掃描電鏡圖。未經汽爆處理的花生殼雖然表面也有許多溝塹和坑壑，未經處理的花生殼表面是由長纖維形成的規則的網狀結構，并覆蓋著均一光滑的片狀結構。而經汽爆處理后，蒸汽爆破花生殼的表皮層受到破壞，出現了很大程度的斷裂及較深的孔洞，網狀纖維消失，取而代之的是熔融態的片層狀結構。片層表面的細長絲狀突起可能是由于汽爆造成花生殼木質素和半纖維素的降解，從而使纖維素析出并附著在物料表面，呈細絲狀。花生殼的熔融變化也說明了在汽爆中發生了一些化學變化，可能是木犀草素提取率提高的原因。

圖5 未處理和蒸汽爆破處理花生殼的掃描電鏡圖Figure 5 Scanning electron micrographs of untreated peanut shell and steam-exploded peanut shell (×1 000)

2.4 紅外光譜分析

A.木犀草素標品 B.爆破處理純化后樣品 C.未爆破處理純化后樣品
圖6 木犀草素標品及純化后樣品紅外圖譜
Figure 6 FT-IR spectra of Luteolin standard and purified samples

2.4 高效液相色譜分析

木犀草素標品的出峰時間為4.7 min，兩個提取純化樣品中均含有木犀草素。由圖7可知，本研究提取純化得到的木犀草素仍含有部分雜質，與紅外光譜分析一致。經爆破處理后，純化樣品中的木犀草素含量顯著增加，與紫外分光光度法檢測的結果一致，測得木犀草素含量在純化后凍干品中達到32.81%。說明蒸汽爆破預處理，可以顯著提高木犀草素的提取率。

A.木犀草素標品 B.爆破處理純化后樣品 C.未爆破處理純化后樣品
圖7 木犀草素標準品、未爆破處理純化后樣品和爆破處理純化后樣品HPLC圖
Figure 7 Luteolin standard,unexploded purified sample and exploded purified sample HPLC diagram

3 結論

將花生殼進行蒸汽爆破預處理，花生殼木犀草素得率顯著提高。經響應面分析以及回歸模型預測，蒸汽爆破預處理的最佳條件為蒸汽爆破壓強1.25 MPa，維壓時間46.0 s，含水率16%。在該條件下，木犀草素提取率為0.926%，約為未處理的2倍。蒸汽爆破預處理后的花生殼木質素、纖維素發生斷裂和降解，表面結構變得松弛有空隙，溶劑滲透加快，促使木犀草素提取率增加。通過分析紅外光譜圖和HPLC圖譜得出，蒸汽爆破純化后樣品中主要物質為木犀草素，其含量在純化后凍干品中達到32.81%，遠高于未蒸汽爆破處理樣品。因此，蒸汽爆破預處理能夠明顯增加花生殼提取物中木犀草素的提取率。本研究發現蒸汽爆破技術使花生殼中木犀草素的結構發生了一定程度的改變，但具體改變的方向和影響值得進一步探討。