外周血MAIT細胞數量在肝細胞癌患者診斷及預后中的應用研究

胡 晟

重慶市第四人民醫院肝病科 (重慶， 400000)

肝細胞癌是全球高發的惡性肝臟腫瘤，其發病率逐年升高[1]。肝細胞癌患者往往預后差、總體生存率低[2]。尋找具有更高靈敏度和特異性的生物標志物對于促進肝細胞癌的早期診斷和預后評估具有十分重要的意義。黏膜相關恒定T細胞(MAIT)是新近發現的一種進化保守的T淋巴細胞，其表面標志物為CD3+CD161+Vα7.2+，主要分布于腸道黏膜固有層、肝臟和外周血中，在抵御細菌感染的過程中發揮重要作用，同時也參與多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發生發展[3]。近年來，已有研究顯示MAIT參與多種肝臟疾病的發生發展，但在肝細胞癌中的作用研究仍較少[4]。此外，已有研究發現外周血中MAIT的數量與結腸癌、胃癌、肺癌患者的臨床特征具有一定的相關性，提示外周血中的MAIT可作為腫瘤的輔助診斷方法[5,6]。本研究探討了肝細胞癌患者外周血MAIT數量在肝細胞癌診斷和預后判斷中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究獲得我院倫理委員會審批通過，所有受試人員均知曉本研究操作所具有的全部風險，并簽署知情同意書。納入標準：①年齡20～70歲；②符合《原發性肝癌診療規范(2017年版)》中肝細胞癌診斷標準[7]；③確診后尚未接受手術和放化療治療。排除標準：①患有其他惡性腫瘤；②合并有感染、心腦血管疾病、自身免疫性疾病、炎癥性疾病或其他全身系統性疾病；③依從性差或無法配合研究者。收集我院初診確診的肝細胞癌患者32例作為實驗組，其中男18例，女14例；年齡25～68歲，平均(48.5±17.5)歲。此外，本研究納入32例健康體檢人員作為對照組，其中男17例，女15例；年齡21～65歲，平均(44.5±20.4)歲。對照組與實驗組患者在年齡、性別方面比較，差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集與分離 在清晨空腹條件下，分別收集兩組人員外周血10ml加入含EDTA的抗凝試管中，立即進行分離。取新的50 ml離心管，將10 ml外周血加入離心管中，隨后用注射器緩慢加入等量10 ml Percoll分離液(1.073 g/ml)，保持外周血與Percoll分離液之間的液面不被打破，以2 000 rpm離心30 min。離心后可見兩液相界面有白色膜狀層。用巴氏吸管小心吸取中間白膜層，加入10 ml PBS緩沖液充分混勻，以2 000 rpm離心10 min，離心后可見細胞團塊沉淀于離心管底部，此細胞團塊則為包含MAIT的外周血單個核細胞。

1.2.2 MAIT細胞數量檢測 將上述外周血單個核細胞進行計數，調整濃度為1×1010/L，吸取100 μl細胞懸液加入流式管中，分別加入10 μl PE Mouse Anti-Human CD3抗體(BD phaemingen公司)、10 μl APC Mouse Anti-Human CD161抗體(BD phaemingen公司)、10 μl FITC anti-human TCR Vα7.2 antibody(Biolegend公司)，充分混勻后于室溫下避光孵育30 min。隨后加入PBS緩沖液5 ml，混勻后以2 000 rpm離心5 min進行清洗。清洗后每管加入PBS緩沖液200 μl，通過FACSVerse 流式細胞儀進行檢測，分析MAIT數量與比例。其中MAIT/T細胞比例定義為CD3+CD161+Vα7.2+MAIT占CD3+T細胞的百分比，MAIT絕對數量定義為1 μl外周血中含CD3+CD161+Vα7.2+MAIT數量。

1.2.3 隨訪方法 實驗組患者采用門診、電話隨訪等方式進行隨訪，隨訪以患者確診當日為起點，截止時間為2018年11月30日，隨訪時間為10～48個月。本研究實驗組患者均按期隨訪，無失訪率。對照組患者采用電話隨訪方式，了解其生活及患病情況。對照組人員在隨訪中均未發生肝臟疾病或其他惡性腫瘤。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，采用Mann-WhitneyU檢驗比較外周血MAIT細胞數量。通過t檢驗比較實驗組患者臨床數據與外周血MAIT數量之間的相關性。通過ROC曲線下面積(AUG)明確外周血MAIT數量作為肝細胞癌診斷的診斷效能。通過Kaplan-Meier方法計算生存率和Log-rank檢驗進行組建生存曲線比較。檢驗水準α=0.05，P<0.05認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 兩組人員外周血MAIT數量 對照組人員的MAIT比例為(3.14±0.19)%，而實驗組患者MAIT比例為(1.23±0.09)%，明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)。對外周血中MAIT數量進行分析，結果發現對照組人員外周血中MAIT數量為(65.22±2.74)個/μl，實驗組患者明顯降低，僅為(25.78±1.92)個/μl，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.001)。

2.2 實驗組患者外周血MAIT數量與臨床參數的相關性分析

為了探討外周血MAIT數量在肝細胞癌中的臨床應用價值，從年齡、性別、腫瘤大小、結節數量、遠處轉移與否、甲胎蛋白(AFP)水平、Child-Pugh分期、TNM分期7個層面對實驗組患者進行分組，對比不同亞組患者間外周血MAIT數量的差異。TNM分期為III～IV期患者中，其外周血MAIT細胞數量減少更為明顯與Ⅰ～Ⅱ期者比較，差異具有統計學意義。結果證實在肝細胞癌患者，外周血MAIT細胞數量與其性別、年齡、腫瘤大小、結節數量、肝功能分期無關，而與其遠處轉移、AFP、TNM分期有關。見表2。

表2 實驗組患者臨床參數與其外周血MAIT數量的相關性

2.3 實驗組患者外周血MAIT細胞數量作為診斷標志物的效能分析 對實驗組患者外周血MAIT數量進行ROC曲線效能分析，結果提示ROC曲線下面積AUG為0.885，標準誤為0.042，95%置信區間為0.803～0.968(P<0.001)。

2.4 實驗組患者外周血MAIT數量與預后相關性分析 以肝細胞癌患者外周血MAIT均值作為分界值(25.78個/μl)，將實驗組患者分為高MAIT水平組(>25.78個/μl，16例)和低MAIT水平組(<25.78個/μl，16例)，采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗計算兩組患者生存曲線。通過分析，高MAIT水平組患者的中位生存時間為30.5個月，低MAIT水平組患者的中位生存時間為21個月，高MAIT水平組患者的生存時間明顯高于低MAIT水平組，兩組差異具有統計學意義(χ2=7.028，P=0.008)。

3 討論

肝癌是我國高發的惡性腫瘤之一，據我國國家癌癥中心2018年公布數據，肝癌以9.59%的發病率位居我國癌癥發病率第4位。在青年男性中，肝癌的發病率更是超過肺癌躍居第一位，發病年齡逐漸低齡化，嚴重影響我國青壯年男性的健康[8]。由于肝細胞癌患者早期常常無特異性癥狀和體征，許多患者確診時已經是中晚期，治療效果差，預后不佳。如何提高肝細胞癌患者的早期診斷效率，評估患者預后，是臨床需要解決的重要問題之一[1]。近年來，已有許多研究對肝細胞癌患者早期診斷和預后評估進行了深入研究，發現了包括miRNA、細胞因子等在內的多種疾病相關標志物。然而，這些疾病標志物在外周血中濃度較低、檢測誤差大，仍存在一定的局限性[9,10]。因此，尋找肝細胞癌高敏感性和特異性的診斷標志物，仍然是當前的重要研究目標。

MAIT由Porcelli等于1993年首次發現其存在于腸黏膜淋巴組織中，具有由一條Vα7.2-Jα33鏈和另一條限定的Vβ2或Vβ13鏈構成恒定的T細胞受體，是一群進化相對保守的T淋巴細胞[11]。不同于其他T細胞，MAIT細胞能夠識別主要組織相容復合體相關分子1(MR1)，限制性呈遞微生物來源的維生素B族代謝產物，從而發揮抗菌功能，是人類T細胞的重要亞群，廣泛參與人體的各種生理和病理過程[12～14]。近年來，研究結果顯示MAIT細胞除了存在腸道黏膜外，還廣泛存在于肝臟和外周血中。在肝臟中，MAIT的數量占全身MAIT數量的20%～50%；而在外周血中，MAIT的數量更占外周血循環中T細胞數量的1%～10%[4]。外周血和肝臟中MAIT數量改變，導致MAIT在其中的分布比例不同，往往與肝臟疾病的發生、發展密切相關[15]。Ashare等發現，丙型肝炎病毒感染后患者外周血的MAIT數量明顯減少，與丙型肝炎患者肝臟纖維化的程度明顯相關[16,17]。但肝細胞癌患者外周血中的MAIT細胞數量是否發生變化，目前仍沒有報道。發現肝細胞癌患者外周血中MAIT占T細胞的比例較對照組人員顯著降低。且MAIT的絕對數量也明顯減少，僅為對照組人員的1/3。這提示MAIT可能參與了肝癌的發病與進展。既往文獻報道，MAIT細胞可以參與惡性腫瘤的發病過程，在腎癌、結腸癌等腫瘤組織中均發現有MAIT的浸潤[5]。已有學者推測這些浸潤的MAIT由外周血循環進入腫瘤組織，通過分泌一系列炎癥因子，改變局部腫瘤微環境，調控腫瘤細胞的功能，外周血中MAIT數量減少可能正好反映了腫瘤進展的程度。由本研究結果，我們推測在肝細胞癌患者中，外周血MAIT也可能通過同樣的機制進入肝臟并浸潤在腫瘤組織周圍，導致外周血MAIT的減少，同時它也參與了肝細胞癌的發病。

肝細胞癌患者年齡、性別、腫瘤大小、結節數量和肝功能情況并不影響外周血中MAIT的數量。這與既往的研究結果相似，在不同年齡、性別的人群中MAIT數量并無很大差異[18]。而在高AFP(>400 μg/L)、有遠處轉移、高TNM分期(III、IV期)的患者中，其MAIT數量更低。這提示，惡性程度更高的肝細胞癌患者，其外周血的MAIT降低更為明顯，特別是對于有遠處轉移的患者，其平均MAIT細胞數量僅為(20.45±3.18)個細胞/μl，為所有亞組中最低，這可能是MAIT細胞在轉移灶中也存在大量浸潤，從而進一步減少了其外周血中的數量。

已有實驗結果證實，外周血MAIT數量可作為膿毒癥的早期診斷指標[19]。既然肝細胞癌患者的外周血MAIT數量對比正常人具有明顯的差異，那么這個指標是否可以作為肝細胞癌的診斷標志物，并用于評估患者的預后？我們通過ROC曲線對MAIT數量的診斷效能進行分析，結果提示外周血MAIT數量在診斷肝細胞癌中具有較高的準確性，可作為肝細胞癌的診斷標志物之一。既往文獻報道，當前診斷肝細胞癌最常用的指標AFP的AUG約為0.85～0.9[20]。我們的結果不僅發現外周血MAIT數量與AFP的高低具有較高的相關性，同時也提示其可與AFP進行組合，共同作為肝細胞癌的診斷指標，提高了臨床診斷的敏感性和特異性。

MAIT數量在疾病、特別是惡性腫瘤患者的預后評估中，同樣具有重要意義。本研究結果提示外周血中較低的MAIT數量預示患者預后更差。外周血MAIT數量不僅可作為肝細胞癌診斷的重要輔助手段，也是判斷患者預后的重要依據。

然而，肝細胞癌患者肝臟和轉移灶組織中MAIT浸潤情況與數量、MAIT通過何種機制參與了肝癌的發生、發展等問題仍需要進一步研究。此外，本研究樣本數較少，研究結果尚需在大樣本的臨床實驗中進一步確認。