miRNA-221/222基因多態性及肝功能指標與乙型肝炎病毒相關原發性肝癌的關聯性研究*

韓豎霞 張平安 趙友云

1. 武漢大學人民醫院檢驗科 (湖北 武漢， 430060) 2.湖北省中醫院檢驗科

乙型肝炎病毒(HBV)相關原發性肝癌(HBV-PHC)具有惡性程度高、發展速度快、治療困難、生存期短、死亡率極高的特點，是世界上第五位常見的腫瘤[1]。HBV感染后可出現不同的疾病轉歸，如隱匿性肝炎、急性肝炎、慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)或PHC[2]。微小RNA(miRNA)是近年來發現的一類普遍存在于動植物體內的非編碼、短序列的小分子RNA，許多研究發現，疾病的發生、發展不僅與基因的突變和重排有關，也與miRNAs的調控密切相關[3]。miRNA-221/222位于染色質Xp11上，其中miRNA-221可以在所有組織中表達，已知其可靶向許多關鍵性腫瘤抑制位點。許多研究已證實miRNA-221/222在PHC的發生、發展的各個方面起重要作用[4]。但是，關于miRNA-221/222基因多態性與HBV-PHC的發生是否相關卻鮮有報告。本研究通過分析HBV感染后不同轉歸的患者中miRNA-221/222基因多態性及肝功能指標的差異，評估miRNA-221/222基因多態性及肝功能指標在HBV-PHC的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 295例患者均為2015年1月至2017 年12月在該院住院的患者，其中HBV-PHC患者94例、LC患者104例、CHB患者97例。HBV-PHC組男72例，女22例，年齡30～81歲，平均54.45歲；CHB組男66例，女31例，年齡25～78歲，平均51.94歲；LC組男74例，女30例，年齡21～78歲，平均54.55歲。各組患者在性別和年齡方面比較，差異無統計學意義。

1.2 診斷標準 CHB的診斷標準:依據2015年中華醫學會肝病學分會、中華醫學會感染病學分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的標準。LC的診斷標準：依據2015年中華醫學會肝病學分會、中華醫學會感染病學分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的標準，同時有臨床提示或組織學檢測存在肝硬化的證據；病因學明確的HBV感染的證據；通過病史或相應的檢查予以明確或排除其他常見的能引起肝硬化的病因如HCV感染、酒精和藥物等。PHC的診斷標準：參照2011年中國衛生部醫政司修訂的PHC診療規范中的標準。①具有肝硬化以及HBV感染的證據。②典型的HCC影像學特征：a.如果肝臟占位腫塊直徑≥2cm，CT和MRI兩項影像學檢查中有一項顯示肝臟占位性病變具有上述肝癌特征；b.如果肝臟占位腫塊直徑為1～2cm，則需要CT和MRI兩項影像學檢查都顯示肝臟占位性病變具有上述肝癌特征，③血清甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L持續1個月或≥200 μg/L持續2個月，并能排除其他原因引起的AFP升高。臨床診斷為HCC，要求同時滿足以下條件中的①+②a兩項或者①+②b+③三項。

1.3 排除標準 均排除合并其他嗜肝病毒感染的肝炎或合并HIV感染者；伴有心、腎、肺、血液、代謝及胃腸道嚴重原發病者;不能合作或精神病患者；孕婦或哺乳期婦女；過敏體質或多種藥物過敏的患者。

1.4 肝功能指標檢測 包括肝功能8項指標(ALT、AST、 ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb)，由羅氏module P800全自動生化分析儀檢測。

1.5 基因組DNA的提取及miRNA-221/222基因分型 用基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司生產)提取人類基因組DNA，用超微量核酸分析儀測定DNA含量，然后-20℃保存備用。根據人類miRNA-221/222基因rs2858061位點C/G和rs2858059位點C/T，采用Vector NTI 11.0軟件設計引物和MGB探針序列(見表1)，并同時標記FAM和VIC熒光集團作為基因分型標記，合成引物及探針，利用雙重FQ-PCR技術同步檢測標本中miRNA-221/222基因rs2858061位點C或G，rs2858059位點C或T。

表1 FQ-PCR的引物和探針序列

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件包對ALT、AST、 ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb數據分布進行正態性檢驗。數據不服從正態分布的檢測值采用中位數(四分位數間距)[M(P25～P75)]描述。組間差異比較采用非參數Kruskal-WallisH及Mann-WhitneyU檢驗；計數資料采用率(%)描述，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者肝功能結果 見表2。3組患者8項結果比較經Kruskal-WallisH檢驗，差異均有統計學意義(P<0.01)。其中HBV-PHC組患者GGT、ALP和AST水平明顯高于CHB組和LC組，差異有統計學意義(P<0.05),但CHB組與LC組之間無差異(P>0.05)；3組間ALT和TP水平差異均有統計學意義(P<0.05)；HBV-PHC組TBil、DBil、Alb水平與LC組無顯著性差異(P>0.05)。

表2 肝功能指標在3組患者間的比較 [M(P25～P75)]

2.2 miRNA-221/222基因多態性的分布情況 見表3。由表3可見，在miRNA-221基因rs2858061位點中，與CC基因型相比，CG基因型和GG基因型在HBV-PHC組、CHB組和LC組中均無統計學差異(P>0.05)；等位基因C和G的分布在3組中無統計學差異(P>0.05)。miRNA-222基因rs2858059位點中，與TT型相比，CT基因型和CC基因型在HBV-PHC組、CHB組和LC組中均無統計學差異(P>0.05)；等位基因C和T的分布在3組中均無統計學差異(P>0.05)。

表3 miRNA-221/222基因多態性在3組患者間的分布比較 [n(%)]

3 討論

PHC發病原因尚不明確，許多研究顯示，HBV感染與肝癌的發生存在較強的相關性。雖然現代治療方式的應用使得其臨床療效得到了顯著提升，但因其早期的檢出率和確診率較低，導致其死亡率依然居高不下[5，6]。 因此PHC的預防、診斷及治療受到各界關注，尋找其潛在的分子標志物等相關的研究已成為熱點。

隨著檢測技術的改進和檢測經驗積累，肝功能相關指標檢驗的準確性、敏感性及穩定性均得到了顯著提升，應用范圍也不斷拓展，已成為肝臟疾病診斷和治療的重要內容[7]。目前臨床對于肝功能監測常采用的指標主要有ALT、AST、ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb 8 種。本研究顯示，HBV-PHC組GGT、ALP和AST水平明顯高于CHB組和LC組，差異有統計學意義(P<0.05),CHB組與LC組之間無差異(P>0.05)；3組之間ALT和TP水平均有顯著性差異(P<0.05)。分析原因，PHC患者的肝功能會出現嚴重紊亂，而ALT、AST是主要存在于肝細胞中的兩種酶，前者多存在于細胞漿內，后者多存在于細胞漿內的線粒體中，當肝細胞受到損傷時，ALT被釋放后進入血液中從而使其血中濃度出現升高，當肝細胞損傷嚴重，線粒體受到損傷時，AST也會滲入血液中，而使其濃度升高。血清中的GGT主要來自肝膽組織，健康人血清中的 GGT 水平很低，而膽汁中的水平很高。當肝細胞受到炎癥、腫瘤或膽汁淤積的刺激時，GGT的合成便增加，血清中的 GGT 水平會明顯升高。ALP在肝內外梗阻性黃疸時一般會增高。研究中還發現，HBV-PHC組患者的TBil、DBil、Alb水平與LC組比較無顯著性差異(P>0.05)。TBil 和 DBil 可以判斷是否存在溶血及肝膽系統的功能狀態，普通肝病、膽囊炎、精神因素、膽囊結石等都可以造成膽紅素代謝障礙,從而引起膽紅素升高，在診斷原發性肝癌時無特異性，與許多研究一致。 因此，本研究顯示，GGT、ALP、AST、ALT、TP可以用于HBV-PHC與LC的鑒別診斷,其中ALT和TP還可以用于乙型肝炎肝硬化的早期鑒別。

miRNA是一種廣泛存在于真核生物中、大小為20～22個核苷酸的內源性單鏈小分子RNA。它在生物進化的過程中呈現高度保守的特點，在細胞中具有時空特異性表達模式。雖然此類RNA不編碼蛋白，但是其通過與靶基因序列特異性相互作用，在轉錄和翻譯水平中調節相關的基因表達，以此參與生物的細胞增殖和凋亡、器官形成及生長發育調控等進程[8，9]。隨著研究的深入，越來越多的miRNA被發現，許多研究顯示多種miRNAs參與了PHC的形成、演進以及轉移過程。miRNA-221/222位于染色質Xp11，miRNA-221與miRNA-222擁有共同基因序列和靶基因，且能與目標基因特定序列互補配對，此段核苷酸吻合度最為重要，與靶mRNA結合起重要作用。已有研究顯示miRNA-221/222與肝癌的發生密切相關,與正常組織相比，PHC中有大量異常表達的 miRNAs[10，11]。SNP是在基因水平上由單個核苷酸的變異而引起的DNA序列的多態性，也是最常見的一種可遺傳的變異。越來越多的研究表明，miRNA相關的單核苷酸多態性(miRNA-SNP)可以通過影響miRNA的合成、與靶基因結合等方式參與基因功能的調節,影響細胞的調控過程，對許多腫瘤細胞組織，如甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等的表達有不同程度的上調或下調，在腫瘤發病機制中發揮重大作用,這也是目前生命科學領域的研究熱點[12～16]。

本研究發現，miRNA-221基因rs2858061位點中，幾個基因型的分布在3組中差異均無統計學意義(均P>0.05)。雖然本研究未證實miRNA-221/222基因多態性與HBV-PHC的發生有一定的相關性，但是由于研究病例的數量及人群的限制，可能會有一定的片面性。未來會加大其他病例的收集和分析研究,進一步研究miRNA基因及其靶點的多態性與HBV-PHC的相關性,探索肝癌早期診斷的新標志，并為肝癌的病因、治療和預后提供新的思路。