NK細胞、T淋巴細胞、調節性T細胞檢測在上消化道腫瘤病情評估中的價值

毛 菊，楊雯雯，陳 穩，沈國棟，徐婷娟，程 民，胡世蓮

(中國科學技術大學附屬第一醫院腫瘤內科，安徽省立醫院腫瘤內科，安徽省老年醫學研究所腫瘤分子實驗室，腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室，合肥 230001)

在腫瘤的發生發展過程中,免疫系統起著至關重要的作用。EHRLICH[1]提出免疫監視理論,認為免疫系統的一項重要功能是從人體中檢測和消除腫瘤細胞。隨著經濟的發展、生活節奏的加快以及癌癥發病率的不斷攀升，我國上消化道腫瘤患者數量日益增長，上消化道腫瘤患者常伴有免疫功能障礙，機體的免疫功能狀態影響腫瘤的發生發展以及預后。檢測上消化道腫瘤患者外周血調節性T細胞、NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞的比例，對患者的機體免疫功能監測、臨床治療以及預后判斷具有重要的指導意義。鑒于此，筆者檢測102例上消化道腫瘤患者外周血中NK細胞、調節性T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞的比例，探討上述細胞比例與患者臨床分期之間的關系。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2017年4月中國科學技術大學附屬第一醫院收治的上消化道惡性腫瘤患者102例，按腫瘤分期分為2組：對照組45例，均為Ⅱ—Ⅲ期患者，男33例、女12例，年齡42～77歲、平均(63±1)歲，病理類型：食管癌11例、胃癌34例；觀察組57例，均為Ⅳ期患者，男50例、女7例，年齡46～82歲、平均(63±1)歲，病理類型：食管癌24例、胃癌33例。2組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入選標準

納入標準：1)所有病例均經病理學確診符合食管癌或胃癌病理學診斷標準(參照2010版消化系統腫瘤WHO分類)[2-3]；2)未服用激素類藥物或接受免疫抑制劑治療；3)臨床分期標準：食管癌、胃癌臨床分期依據2017年第八版AJCC，TNM分期中T、N、M的定義分別為原發腫瘤T、區域淋巴結N、遠處轉移M，臨床分期包括Ⅰ—Ⅳ期[2-3]。排除標準：1)未經明確診斷的食管癌或胃癌；2)明確診斷為食管癌或胃癌但未做全NK、T、Treg細胞檢測者。

1.3 試劑與儀器

T細胞亞群檢測試劑盒、NK檢測試劑盒、調節性T細胞檢測試劑(包括CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5、CD45-APC)，上述試劑盒均購自美國Beckton Dickinson公司；使用BD FACS Calibur流式細胞儀(美國Beckton Dickinson公司)及Cellquest軟件進行細胞檢測與分析。

1.4 檢測方法

1.4.1 調節性T細胞檢測

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中依次加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5和CD45-APC抗體，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.4.2 NK細胞檢測

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD16+CD56-PE抗體，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.4.3 T淋巴細胞亞群檢測

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PERC P/CD4-APC抗體，避光孵育15 min；加入500 μLBD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.5 統計學方法

2 結果

與對照組相比，觀察組外周血調節性T細胞的比例差異無統計學意義(P>0.05)，外周血CD4+T細胞比例明顯降低，外周血CD8+T細胞比例、NK細胞比例明顯增高，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 2組NK細胞、T淋巴細胞亞群及調節性T細胞比例比較

3 討論

腫瘤的發生與內外環境各種因素的綜合作用相關，正常細胞受到有害刺激，惡性突變成癌細胞，繼而持續擴增形成腫瘤組織[4]。惡性腫瘤患者常伴有機體免疫功能的異常，作為細胞免疫最重要的T淋巴細胞通過功能各異的T淋巴細胞亞群來發揮免疫調控作用[5]。在上消化道腫瘤的發生、發展過程中，機體的免疫功能也發生了顯著改變，主要表現為免疫防御和免疫監視功能的降低。隨著對腫瘤免疫機制的不斷探索和腫瘤免疫營養治療的應用，較多的細胞免疫檢測指標用于判斷腫瘤患者的疾病狀態、治療效果及預后，其中調節性T細胞、NK細胞、T細胞亞群的測定較為常用。

調節性T細胞是具有一定免疫抑制功能的T細胞亞群，即是一群CD4+CD25+CD127low T細胞。NK細胞(CD3-CD16+/CD56+)是非抗原依賴性免疫效應細胞，可以不經致敏直接殺傷腫瘤細胞[6]，具有抗腫瘤免疫，與細胞毒性T淋巴細胞在機體免疫防御方面發揮著重要的作用[7-8]。研究表明在胃癌中重建NK細胞功能可以很好地預防腫瘤免疫逃逸，是機體免疫監視系統的重要組成部分，也是機體抗御感染和防止細胞惡性轉化的重要免疫調節細胞[9]。T細胞可分為Th(CD3+CD4+)和Ts(CD3+CD8+)細胞。若T細胞總數或CD4+/CD8+T細胞比值降低，即可視為免疫調節功能紊亂，易發生腫瘤或自身免疫病。已有研究顯示，調節性T細胞，NK細胞，T淋巴細胞亞群測定是反映腫瘤患者的機體免疫功能狀態常用指標[10-11]。王祝榮等[13]選取226例宮頸癌患者和同期健康體檢者60例女性作為對照組,結果表明T淋巴細胞亞群與NK細胞水平可反映宮頸癌患者的細胞免疫功能,且宮頸癌臨床分期越晚,細胞免疫功能越低。王勇[14]認為測定惡性腫瘤患者外周血中T淋巴細胞亞群數目變化對臨床確定治療方案及療效觀察具有一定意義。腫瘤微環境中的T淋巴細胞具有至關重要的免疫監視作用[15]。鐘銳等[16]認為晚期胃癌患者外周血中Treg(CD4+CD25+CD127low)細胞的表達水平明顯高于健康體檢者，且化療后降低，有助于判斷化療療效。趙強等[17]認為食管癌外周血Treg(CD4+CD25+CD127low)細胞比例能較敏感、特異地反映其細胞免疫功能狀態，有可能成為反映食管癌免疫狀態及疾病進展的外周血標志物。

本研究中Ⅳ期上消化道腫瘤患者Treg細胞的表達水平與Ⅱ、Ⅲ期相比沒有統計學差異，可能與本研究中病例數不夠以及將胃癌、食管癌整合在一起分析的因素相關。本研究結果顯示上消化道腫瘤臨床Ⅳ期患者CD4+T細胞的比例較Ⅱ、Ⅲ期患者明顯降低，CD8+T細胞和NK細胞比例較Ⅱ、Ⅲ期患者明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明不同臨床分期的腫瘤患者外周血免疫狀態存在差異，臨床Ⅳ期患者的免疫功能比Ⅱ、Ⅲ期患者更差。當上消化道腫瘤患者的CD4+T細胞的比例明顯降低，CD8+T細胞比例明顯升高且調節性T細胞比例升高時表明患者目前的免疫力較差，在治療中需要考慮改善患者免疫力如采用腫瘤免疫營養支持治療的方法。通過檢測上消化道腫瘤患者外周血NK、T、調節性T細胞可以較早評估患者免疫狀況，對臨床診療活動具有一定的指導意義。綜上所述，檢測上消化道腫瘤患者外周血調節性T細胞、NK細胞、T淋巴細胞的比例，有助于發現上消化道腫瘤患者的免疫功能是否存在異常，進而指導臨床醫生對上消化道腫瘤患者的病情判斷、治療方案的制定及預后評估。