單味中草藥提取物對豬源沙門氏菌的抑菌效果

倪吉榮

摘 ?要：本試驗旨在探討黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥對豬源沙門氏菌的抑菌效果。試驗制備黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥提取物后，采用牛津杯法測定五種中草藥提取物對豬霍亂沙門氏菌的抑菌作用，并采用梯度稀釋法測定其最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），觀察其對沙門氏菌的體外抑制作用。結(jié)果表明，空白對照組無抑菌圈，陽性對照組抑菌圈直徑為（20.13±1.47）mm;與對照組相比，苦參、黃芪組抑菌作用差異顯著（P>0.05），敏感程度均為高敏;黃連、黃柏、甘草組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），敏感程度為高敏或中低敏;黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥的MIC濃度分別為20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。試驗顯示，黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥均可一定程度地抑制豬源沙門氏菌，苦參抑制作用最強(qiáng)，與抗生素效果一致，其次分別為黃芪、黃連、黃柏、甘草。

關(guān)鍵詞：單味中草藥;豬源沙門氏菌;抑菌效果

中圖分類號：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2019）06-0024-03

沙門氏菌寄生于人類和動物腸道內(nèi)，屬于革蘭氏陰性桿菌，是一種常見的人獸共患病病原菌，它不僅能導(dǎo)致仔豬副傷寒、母豬流產(chǎn)等動物性癥狀，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、腸胃炎和食物中毒[1]。豬沙門氏菌病又稱豬副傷寒，致病菌主要有豬傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等，常發(fā)生于6月齡以下仔豬，以1～4月齡仔豬多發(fā)，臨床上常表現(xiàn)為急性（敗血癥）、亞急性和慢性三種類型，其中急性病死率達(dá)90%以上，慢性病死率達(dá)25%～50%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。據(jù)臨床試驗研究，引起豬沙門氏菌病的主要病原菌為豬傷寒沙門氏菌，傳統(tǒng)抗生素的廣泛應(yīng)用雖然控制了沙門氏菌的傳播，但也存在著極為嚴(yán)重的安全隱患，導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、畜產(chǎn)品抗生素殘留等問題，影響著豬沙門氏菌病的治療效果和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，對人體健康也造成了極大的影響[3]。

中草藥作為我國傳統(tǒng)藥材，多系天然植物成分，具有抗菌、抗病毒、抗毒素、免疫調(diào)節(jié)等作用，且不易殘留、毒副作用小，具有西藥無法比擬的優(yōu)勢[4]。但是，目前在中藥提取物對豬源沙門氏菌的抑菌效果的研究中，多見于復(fù)方中藥制劑對豬沙門氏菌病的治療效果評價，對于單味中藥提取物對豬源沙門氏菌病抑菌效果的評價研究較少，致使中藥提取物的臨床應(yīng)用缺乏一定的依據(jù)。本文就單味中草藥對豬源沙門氏菌的抑菌效果進(jìn)行分析，結(jié)果表明黃連等五種中草藥對豬源沙門氏菌有一定的抑制作用[5]，苦參抑制作用最強(qiáng)，且與抗生素效果一致，其次分別為黃芪、黃連、黃柏、甘草。

1 ?材料與方法

1.1 試驗材料

黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草購自毫州市林中森藥業(yè)銷售公司。硫酸慶大霉素購自杭州微生物試劑有限公司。豬霍亂沙門氏菌（NEAU0452）購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心[6]。營養(yǎng)瓊、酵母浸粉脂和瓊脂粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，牛肉浸膏和蛋白胨購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 ?研究方法

1.2.1 提取物的制備

黃連單味藥提取物的制備：稱取一定質(zhì)量的經(jīng)粉碎處理的黃連，按料液比1∶10加入蒸餾水浸泡30 min，然后用超聲清洗儀處理 ?20 min，再用電爐加熱至沸，保持微沸1 h，過濾后加入等量蒸餾水，保持微沸20 min，過濾，將兩次濾液合并，轉(zhuǎn)至60 ℃水浴鍋濃縮至0.5 g/mL。其余四種中藥提取制備同黃連。

1.2.2 各提取物抑菌效果的測定與評判

試驗分為空白對照組、陽性對照組、各單味中草藥組，空白組即為蒸餾水200 μL給藥，陽性對照組為硫酸慶大霉素10 μg/mL給藥，各單味中草藥組分別以0.5 mg/mL給藥[7]。

抑菌作用評定采用牛津杯法。將待試細(xì)菌制成細(xì)菌混懸液，調(diào)菌落總數(shù)為106 CFU/mL，用滅菌棉簽在平皿培養(yǎng)基表面均勻涂布細(xì)菌混懸液[8]。采用無菌操作將經(jīng)過高壓滅菌處理的牛津杯垂直放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基緊密接觸，隨后進(jìn)行給藥，每種菌做5個平行[9]。加滿后置37 ℃培養(yǎng) ? ?16 h～18 h，觀察牛津杯孔周圍是否有透明圈，用游標(biāo)卡尺直接測量其大小，記錄數(shù)據(jù)。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：抑菌圈直徑≥20 mm為高敏，抑菌圈直徑在15 mm～20 mm之間為中敏，抑菌圈直徑≤15 mm為低敏，無抑菌圈為耐藥[10]。

1.2.3 各提取物對致病菌最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的測定

在試管架上依次排列裝有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的滅菌試管，在試管中加入一定體積的中草藥提取物使培養(yǎng)基與所加中草藥提取物溶液總體積為5 mL，制得藥物濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、80 mg/mL、160 mg/mL、320 mg/mL和640 mg/mL培養(yǎng)基。向上述所制含不同藥物濃度的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別加入 0.5 mL備用菌液，混勻備用。將各試管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h。從培養(yǎng)20 h的試管中取出100 μL混合液，均勻涂布于固體LB平板，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以第一個出現(xiàn)稀疏單菌落的平板所對應(yīng)的藥物濃度為最低抑菌濃度[11]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理，試驗數(shù)據(jù)均為平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。樣本獨(dú)立性采用t檢驗，數(shù)據(jù)有效性采用卡方檢驗。

2 ?試驗結(jié)果

2.1 各提取物對豬源沙門氏菌的抑制程度

五種中草藥提取物抑菌作用結(jié)果見表1。空白對照無抑菌圈，陽性對照抑菌圈直徑為（20.13±1.47）mm。與陽性對照組相比，苦參、黃芪組抑菌作用差異不顯著（P>0.05），敏感程度均為高敏;黃連、黃柏、甘草組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），敏感程度為高敏或中低敏。

2.2 各提取物對豬源沙門氏菌的MIC

表2為各提取物對致病菌MIC的測定結(jié)果，五種MIC濃度分別為20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。結(jié)果表明，抑菌效果最佳的是苦參，其次分別為黃芪、黃連、黃柏、甘草。

3 ?討論

隨著土霉素、四環(huán)素、磺胺類和喹諾酮類抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性以及藥物殘留等問題極大地?fù)p害了食品質(zhì)量安全，也威脅著人類健康。因此，尋找安全有效的飼用抗生素替代物是目前畜牧業(yè)研究的重要方向，中草藥作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥的瑰寶，具有抗菌、抗病毒、抗毒素、免疫調(diào)節(jié)、補(bǔ)充營養(yǎng)、提高生產(chǎn)性能等作用，且不易殘留、毒副作用小，具有西藥無法比擬的優(yōu)勢，在抗生素替代品研究和提高畜禽生產(chǎn)性能上倍受關(guān)注，成為了當(dāng)今畜牧業(yè)和飼料業(yè)研究的熱點(diǎn)[12]。

本研究基于文獻(xiàn)的積累篩選了五種中草藥，包括黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草，通過制備提取物，分別分析其對豬源沙門氏菌的抑菌效果。黃連清熱燥濕、瀉火解毒，其主要成分小檗堿對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肺炎鏈球菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、痢疾桿菌等均有較強(qiáng)的抗菌作用[13]。苦參苦寒降瀉、瀉火燥濕、清熱解毒，苦參堿可使雞大腸桿菌菌體變形、細(xì)胞質(zhì)固縮、質(zhì)壁分離、菌體中央出現(xiàn)空腔，最終引起細(xì)菌死亡[14]。黃柏苦寒沉降，清熱燥濕、瀉火解毒。黃芪可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，且具有較廣泛的抗菌作用[13]。甘草具有清熱解毒的功效，甘草黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母菌、真菌、鏈球菌等均有抑制作用[15]。

試驗結(jié)果表明，對照陽性硫酸慶大霉素組，苦參、黃芪組抑菌作用有顯著差異，敏感程度均為高敏;黃連、黃柏、甘草組敏感程度為中低敏，且差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥提取物MIC濃度分別為20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。綜上所述，黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥均對豬源沙門氏菌有一定的抑制作用，苦參抑制作用最強(qiáng)，與抗生素效果一致，其次分別為黃芪、黃連、黃柏、甘草。□□

參考文獻(xiàn)：（15篇，略）