食源性相關腹瀉患者糞彎曲菌檢測結果分析

李宏杰 陳志杭 葉斌 葛榮躍 王海明

彎曲菌（Campylobacter spp）是一種重要的人獸共患病的病原體，是引起人胃腸道疾病最主要的病原體之一，使人致病的彎曲菌中99%是空腸彎曲菌，其與沙門菌、志賀菌并列為人類三大腹瀉致病菌，并可帶來其他一些疾病?？漳c彎曲菌為苛養菌，常規的生化檢測較為困難，臨床多以經驗性治療為主，楊峰等［1］研究提示臨床上在治療急性腹瀉時存在一定的用藥不符和抗菌藥物使用不正確的情況。作者應用多重聚合酶鏈式反應（PCR）檢測200例食源性相關腹瀉患者糞便標本中的彎曲菌，以了解與增菌培養分離法檢測結果的關系，為臨床診療與公衛服務提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 對2015年1月至2017年12月本系統12家社區衛生服務中心就診的食源性相關腹瀉患者糞便（或肛拭子）標本采用直接分離與增菌分離相結合的方法常規培養分離獲得200株致瀉菌，其中空腸彎曲菌4株、結腸彎曲菌1株。

1.2 儀器與耗材 VITEK-2 compact全自動微生物分析系統（法國bioMérieux公司）及其苛養菌（NH）配套鑒定卡，基因擴增儀，熒光定量分析儀。

1.3 主要培養基和試劑 Cary-Blair運送培養基（杭州天和微生物試劑有限公司產品），改良木炭-頭孢哌酮-去氧膽酸鹽瓊脂（CCDA）培養基，改良Campy-BAP彎曲菌培養基及藥敏紙片（均為英國Oxoid公司產品），微需氧袋（法國bioMérieux公司產品）。2Taq PCR Master Mix與PCR Marker購自上海生工生物技術有限公司；彎曲菌核酸測定試劑盒（單重、二重與多重熒光PCR法）購自上海之江生物科技股份有限公司。

1.4 儀器校準及室內質控 儀器按廠家要求進行校準并按室內質控的要求完成室內質控。室內質控菌株在直接分離、增菌分離、血清學凝集試驗和生化鑒定上與待檢標本同步，空腸彎曲菌（ATCC33291）由浙江省臨床檢驗中心提供。

1.5 檢測方法 （1）標本采集：采集食源性相關腹瀉患者糞便（或肛拭子）標本，用2支滅菌棉拭子沾取患者糞便后，分別插入2管Carry-Blair運送培養基中，盡快送實驗室檢測，樣品采集遵循統計學要求。（2）多重PCR檢測糞彎曲菌：多重PCR方法參照何蕊等的方法引物設計［2］，單重、二重和多重PCR用相應試劑盒或自行引物組合設計進行熒光PCR檢測。（3）菌株分離鑒定：①菌株分離培養：實驗室收到待檢糞便標本后立即接種于改良CCDA培養基（并用于PCR 檢測），置微需氧袋（5%O2、10%CO2、85%N2）42℃48h，挑取可疑菌落再接種到改良CCDA培養基或哥倫比亞血瓊脂進行純培養，繼續42℃微需氧培養24～48h；另1份待檢糞便標本置微需氧袋42℃增菌培養24～48h后接種于改良CCDA培養基（并用于PCR檢測），同直接分離培養法獲取純培養。②菌株常規生化鑒定：將疑似彎曲菌的純培養物在VITEK-2 compact上使用配套苛養菌（NH）鑒定卡進行菌種鑒定。③菌株PCR鑒定：根據常規生化鑒定結果，再次以PCR（單重、二重與多重熒光PCR法）檢測復核（也包括培養陰性的樣本盲刮平板用PCR再次檢測），單重PCR檢測16S rRNA，二重PCR檢測16S rRNA與map A基因，多重PCR檢測16S rRNA、map A與ceu E基因。

1.6 菌株藥敏試驗 采用CLSI推薦使用的瓊脂紙片擴散法即Kirby-Bauer（K-B）法。將被檢菌制成0.5麥氏單位的菌懸液，均勻涂抹在厚度為4mm的Campy-BAP培養基上，42℃平衡10～15min，貼抗菌藥敏紙片，置微需氧袋42℃孵育48h后按照CLSI標準判讀結果。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件。計數資料采用χ2檢驗（結合確切概率法）分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 增菌前后彎曲菌檢出率 糞便標本直接培養分離法的檢出率為1.50%（3/200），PCR法（多重PCR、單重PCR或二重PCR）直接檢測糞便標本彎曲菌的檢出率均為2.50%（5/200）。由于陽性病例偏少，增菌培養前，二類方法的檢出率無明顯差異（χ2=0.5102，P＞0.05）。增菌后，培養分離法的檢出率為2.00%（4/200），PCR法的檢出率為2.00%（4/200），二類方法的檢出率無明顯差異（χ2=0.0000，P＞0.05）（見表 1），有1例未能分離出菌落但平板盲刮PCR法仍可檢出。

表1 200份糞便標本增菌培養前后彎曲菌的檢出率

2.2 菌種鑒定結果 多重PCR的檢出空腸彎曲菌4例，結腸彎曲菌1例（在二重PCR檢測僅有16S rRNA熒光曲線，在多重PCR檢測有16S rRNA和ceu E兩條熒光曲線）；增菌培養分離法菌種生化鑒定菌種結果與多重PCR一致。

2.3 菌株藥敏結果 所有菌株對碳青霉烯類、氨基糖苷類和-內酰胺類/酶抑制劑復合制劑多敏感，對其他抗菌素可耐藥。

3 討論

在發展中國家，彎曲菌是嬰幼兒感染性腹瀉最常見的病原菌［3］。盡管彎曲菌的流行已引起各界廣泛關注，但由于其暴發少，病死率低，加上培養條件苛刻，許多監測機構（尤其是基層結構）尚未建立起對彎曲菌的監測系統，缺乏有力的控制手段。因此探索適宜的空腸彎曲菌檢測方法顯得尤為重要。

由于陽性病例偏少，可能導致增菌培養前，二類方法的檢出率無明顯差異（χ2=0.5102，P＞0.05），但PCR直接檢測的陽性率還是有高于直接培養分離法的趨勢。RantsiouK等［4］報道，在增菌前定量PCR的檢測靈敏度明顯高于培養分離法，定量PCR的檢測率高達87%（42/48），而培養分離法的檢測率31.25%（15/48）。這可能與標本中的目標菌含量太低（低于培養分離法的檢測限）、“活的非可培養（viable but noncultureable，VBNC）”狀態、營養與培養條件以及抗生素的使用等因素有關。同時，培養基和培養條件的不穩定改變也可能導致菌種生化鑒定失真。增菌可能有利于提高標本中低劑量成活目標菌的培養分離法的檢出率。Lund等［5］實驗時發現有11份雞糞便標本直接接種CCDA平板鑒定結果為陰性，而增菌后再接種CCDA平板時鑒定結果則為陽性。而本資料使用的改良CCDA平板在糞便標本直接接種與增菌后培養分離法的檢測率差異無統計學意義（χ2=0.1454，P＞0.05），可能觀察例數太少，但也說明提高彎曲菌選擇性培養基性能的重要性，建議酌情使用改良CCDA平板或改良的Skirrow血瓊脂平板等，并可直接接種。與此相反，增菌后可能導致PCR法的檢出率有所降低，可能是由于增菌液顯著稀釋了部分標本中目標菌或目標菌的DNA相對濃度而導致檢出率下降。

目前公認，PCR法檢測彎曲菌的敏感度明顯高于培養分離法，特異性強，簡便快速。其中，多重PCR技術特異性更強，也可具有鑒別診斷的作用；培養分離法雖然操作繁瑣，但仍是獲取菌株鑒定、藥敏的基本途徑。因此，應根據檢測目的、自身條件等因素選擇合適的檢測方法和分離程序。多重PCR比較適合于食源性相關腹瀉患者糞彎曲菌的快速檢測，也應重視培養分離法對鑒定與藥敏的地位，努力優化選擇性培養基及培養條件。在VITEK-2 compact全自動微生物分析系統苛養菌（NH）鑒定菌種數據庫里，有空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、胎兒彎曲菌等菌種供系統判定，能夠滿足臨床需要。PCR法是目前對彎曲菌分離菌株進行鑒定的通用參比方法［6］，實際工作中可以根據需要使用單一的或不同的基因組合來檢測，以判定彎曲菌屬種［7-8］，盡可能保留16S rRNA基因檢測在彎曲菌分子診斷與菌屬種鑒定中的基礎作用。而已經發展起來的環介導恒（等）溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術［9］有望得到一致的認可與評價，工作中應做好LAMP檢測多項單一指標的復合評判，為臨床診療提供及時的有用的信息。