酪蛋白胰酶水解物的抗氧化活性及穩定性

陳旭峰，王佳麗，樊偉鑫，許女

（山西農業大學a.實驗教學中心，b.食品科學與工程學院山西太谷030801）

0 引 言

1979年，Brantle等人[1]首先報道發現了一類短肽，其具有類嗎啡活性，這類短肽源自喂食了牛乳酪蛋白酶解產物的豚鼠小腸。該短肽命名為β-酪啡肽-7(β-casomorphins-7，β-CM-7)，是由 7個氨基酸組成，對應于β-酪蛋白第60～66氨基酸殘基片段。此后，人們對于有關乳源性活性肽的研究進展十分迅速，并且逐步成為乳品界的探索重點。人們已經發現，可能廣泛存在一些功能域于乳蛋白多肽鏈中，許多生物活性肽包含在其中，并且蛋白酶水解作用可以將其釋放，使其在體內表現出特定的生理作用。目前人們對于乳源抗氧化活性肽的探究重點為抗高血壓肽[2]、免疫調節肽[3-4]、抗血栓肽[5]、促進金屬離子吸收的肽[6-7]、抗菌肽[8-9]、細胞生長的促進[10]、阿片肽等[11]，而關于抗氧化活性肽的研究則相對較少。

沈浥[12]通過響應面優化了胰蛋白酶水解乳清蛋白以制備抗氧化肽工藝，最終獲得的酶解產物在濃度為10 mg/mL時1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除率為78.78%，并且大孔純化產物通過凝膠過濾色譜Sephadex G-15和反相高效液相色譜(Reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)分離，最終獲得兩個肽段A3a和A3b，具有較好的抗氧化活性。劉志東等[13]則比較了4種不同的酶水解酪蛋白產物的抗氧化性，結果表明木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解產物清除DPPH、超氧陰離子自由基(O2-·)、羥自由基(·OH)的能力強于胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解產物；而后兩者酶解產物的還原性卻強于前兩者。毛學英等[14]和紀銀莉等[15]對牦牛乳酪蛋白酶解過程進行了優化及抗氧化活性研究，結果表明具有DPPH自由基清除能力的酪蛋白酶解產物的制備采用堿性蛋白酶時產量較高，卻具有含量較低的氨基氮，適合作為具有功能性的健康食品基材。

本文主要優化了酪蛋白酶解制備抗氧化肽的工藝，系統研究了體外和體內抗氧化活性，并進行了耐熱性、耐酸堿性、耐消化性和儲存穩定性試驗，為其廣泛的開發和應用提供了數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、DPPH、鄰苯三酚、抗壞血酸(Vitamin C，VC)、丙二醛(Malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒、水楊酸、三氯化鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀等。

酶生產廠家提供的各種蛋白酶的最適反應p H值以及溫度條件如表1所示。

表1 各種蛋白酶的最適反應條件

1.2 儀器與設備

BS2010S電子分析天平、電熱鼓風干燥箱、TDL-4低速離心機、HHS-21-4數顯恒溫水浴鍋、F22E可見分光光度計、R 201D-11旋轉蒸發儀、真空冷凍干燥機、SM 800臨床專用全自動酶標儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 酪蛋白酶解物的制備

稱取酪蛋白30 g溶于500 mL蒸餾水中，加入蛋白酶啟動反應。水解過程中維持最適酶反應溫度，最適pH值，并不斷攪拌，分別在0，30，60，90，120，150，180，210，240 min取樣，調pH到7.0，煮沸滅酶10 min，冷卻后，在4℃，以4 000 r/min離心20 min，測定部分上清液的蛋白水解度，并將其余上清液凍干以分析抗氧化活性。

1.3.2 酪蛋白水解度及酶解物肽濃度的測定

按照文獻[16]中的方法，采用甘氨酸標準曲線法測定水解蛋白液中-NH2的含量(μmol/mL)，水解度計算公式如下：

式中：htot為每g蛋白質的肽鍵毫摩爾數，查得酪蛋白htot=8.2(mmol/g)；6.25×N為水解底物蛋白質含(g/L)，本實驗酪蛋白為11.66。

按照文獻[10]中的方法，采用Folin酚法測定多肽濃度。

1.3.3 體外抗氧化活性測定

按照文獻[17]中的方法，對酪蛋白水解物凍干樣品進行總還原能力、羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2—·)、一氧化氮自由基(NO·)的清除能力和抑制脂質過氧化能力進行測定。

1.3.4 體內抗氧化活性測定

（1）D-半乳糖致衰老模型 將小鼠按體重隨機分為三組，即：正常對照組(每日灌胃生理鹽水)，模型組(每日灌胃生理鹽水)，CTH組(每日灌胃酪蛋白胰蛋白酶水解物 400 mg/kg.bw)，每組各10只，模型組和CTH組每日頸背部皮下注射用生理鹽水配制的滅菌D-gal(150 mg/kg·d)，正常組補充等量生理鹽水，連續6周，自由飲食。

（2）抗氧化指標檢測及方法 采用試劑盒對小鼠血清、肝、腦組織中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量進行測定。

2 結果與討論

2.1 不同蛋白酶對酪蛋白酶解物性質的影響

肽的氨基酸序列和酶解物的抗氧化活性有著密切聯系，各種蛋白酶的底物特異性以及作用位點的不同對其起到決定性作用，根據酶生產廠家提供的酶的最適反應p H值以及溫度條件(見表1)，考察不同蛋白酶對酪蛋白酶解物水解度及DPPH清除率的影響，試驗結果如圖1和圖2所示。

圖1 各種蛋白酶對酪蛋白的酶解進程曲線

由圖1可知，酶解酪蛋白后水解度最高的是堿性蛋白酶和胰蛋白酶。在120 min內，各種酶水解酪蛋白的水解度都隨水解時間的延長而不斷增大，120 min時水解度達到最大值(除堿性蛋白酶外)，之后趨于穩定，說明此時大多數的酪蛋白已經被酶水解成小肽段和游離氨基酸。對于中性蛋白酶，120 min后水解度呈下降趨勢，水解度的降低是由于一些游離氨基酸與小肽的結合作用，由此導致了此類現象的出現。此結果與葉挺等[18]在不同蛋白酶和水解條件對酪蛋白酶解產物性質的影響研究中得到的結論相似，其結果表明堿性蛋白酶水解酪蛋白的速度最快，酪蛋白的水解程度最大，說明酪蛋白上有較多的堿性蛋白酶酶切位點。

圖2 酪蛋白不同酶解產物的DPPH自由基清除率

圖2 為120 min時酪蛋白經各種酶水解產物測得的DPPH清除率。由圖2可知雖然堿性蛋白酶酶解產物的水解度最高，但其產物抗氧化活性卻低于胰蛋白酶酶解產物。因為不同的酶對酪蛋白中所含的各種蛋白的底物特異性以及作用位點有區別，獲得的酶解產物的肽鏈結構和長度有差異，并導致其活性大小也有可能有差別。通常人們預期得到的生物活性肽是分子量較小的短肽。沈浥[12]在酶解乳清蛋白制備抗氧化肽的研究中也得到相似結論，即水解度與抗氧化活性并不總是呈現正比關系。

毛學英等[14]和紀銀莉等[15]以牦牛乳酪蛋白為原料，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶和風味蛋白酶制備酪蛋白酶解產物，并分別測定其DPPH自由基清除活性，發現堿性蛋白酶酶解產物的清除活性顯著高于其他酶解產物(P＜0.05)。劉志東等[13]證明木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解酪蛋白產物比胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解物具有更強的DPPH、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除活性；然而比較其還原能力，則胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解物比木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物強。而在本文中胰蛋白酶水解產物具有最強的抗氧化活性。因此，底物蛋白種類不同，即使都是酪蛋白，來源不同(牦牛和奶牛)，其制備抗氧化肽最適的酶不同。

2.2 酶解工藝優化

2.2.1 底物濃度對水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當條件為pH 8.0，T為50℃，加酶量[E]/[S]為3%時水解120 min，探究底物濃度[S]對酪蛋白水解度以及抗氧化能力的影響，結果見圖3。由圖可知，在[S]為50 mg/mL以內，水解度和抗氧化活性隨底物濃度的升高而不斷增強，當[S]為50 mg/mL時，酶已由于底物而達到飽和，酶分子與底物作用，之間碰撞的可能性很大，產生劇烈反應，水解度(Degree of hydrolysis，DH)和DPPH自由基清除率達到最高，分別為26%和60.2%。隨著增加底物的濃度，體系中水的流動性被高濃度的蛋白所束縛，導致酶分子與底物之間的碰撞機會逐步減少，致使降低酶解的反應速率，另外，蛋白濃度太高，會使得蛋白能夠占據酶分子的部分活性位點，從而使中間產物形成，這些沒有活性的中間產物，抑制了酶解反應，逐步降低了水解度[12]。

圖3 底物濃度對酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.2 加酶量對水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當條件為p H 8.0，T為50℃，[S]為50 mg/mL時，水解120 min，探究加酶量[E]/[S]對酪蛋白水解度和抗氧化活性的影響，結果見圖4。由圖可知，隨著加酶量的增加，水解度和DPPH自由基清除率也顯著提高(P＜0.05)，當[E]/[S]為4%時，底物被飽和，水解度和DPPH自由基清除率均不再顯著提高(P＞0.05)。酶的數量超過一定限度而多余，單位時間內一部分酶分子不能與底物相結合，就會使得水解程度的增加過程變慢。

圖4 加酶量對酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.3 溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當條件為[E]為50 mg/mL，[E]/[S]為4%，pH 8.0時，水解120 min，研究溫度對水解度和抗氧化能力的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著酶解溫度的不斷升高，水解度會逐步增加(P＜0.05)，在溫度為50℃的時候酶解產物的水解度以及DPPH自由基清除率達到最高，當溫度達到55℃時，水解度和抗氧化活性均呈現出下降趨勢。溫度過高或過低時，都會發生抑制作用導致酶的活性降低，其中也可看出水解度和DPPH自由基清除率之間呈線性關系，二者出現了相同變化趨勢，同時溫度過高時會破壞蛋白酶的空間結構，導致其失去活性，使抗氧化活性下降。此研究與侯楚楚[19]研究的酪蛋白水解肽制備條件優化的結果一致，50℃為最佳酶解溫度。

圖5 溫度對酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.4 pH值對水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當條件為[S]為50 mg/mL，[E]/[S]為4%，T為50℃時水解120 min，研究pH值對抗氧化活性以及水解度的影響，結果見圖6。由圖可知，在pH 7.0～8.5之間，水解度和DPPH清除率均呈現先增加后降低的趨勢，在pH 7.5的時候達到峰值。與侯楚楚[19]研究結果一致，在p H小于7.5時，酶解速率非?？?，水解度隨p H的增大而減小；當p H大于7.5時，水解度隨著pH的增大而減小。

圖6 pH對酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.5 時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響

選用胰蛋白酶，當條件為[S]為50 mg/mL，[E]/[S]為4%，T為50℃，pH為7.5時，研究水解時間對抗氧化活性及水解度的影響，結果見圖7。由圖可知，隨著水解時間的不斷延長，水解度會持續增加，在150 min時趨于穩定，水解度達到34.5%，這是由于隨著時間的延長，反應位點不斷被酶分子飽和，導致可以同酶分子作用的肽鍵數目逐步減少；同時產物濃度不斷增加，形成了較強的競爭性抑制作用。在水解時間為120 min條件下，DPPH自由基清除率達到最高，為68.1%。侯楚楚[19]也得到相似結論，研究表明隨著酶解反應的進行，酪蛋白分子逐漸水解成多肽和氨基酸的混合物，在0～30 min內，酶解速率較快，之后慢慢的趨于平緩狀態。這是因為隨著酶解反應的進行，胰蛋白酶酶切作用位點減少，從而反應趨緩。

圖7 水解時間對酪蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.3 酪蛋白胰酶水解物的體外抗氧化活性

由表2可知，酪蛋白胰酶水解物的還原能力隨濃度的增加而增大，說明其具有較強的還原能力，因而具有較高的抗氧化活性，與劉志東[13]的研究結果一致，但本試驗高于其研究的酪蛋白胰酶水解物的還原能力。此酪蛋白酶解物不僅具有可以很好地清除DPPH自由基的能力，對·OH和NO·自由基的清除也有著很好的作用，并且具有濃度相關性，當多肽濃度為10 mg/mL時，對二者的清除率分別可以達到45.2%和61.5%，當濃度升高到30 mg/mL時，其清除率分別達到62.4%和79.5%；另外，其對O2-·及Fe2+誘發的卵黃脂蛋白脂質過氧化都具有一定的清除和抑制能力。Pritchard等[20]從商業切達干酪中分離純化出一種DPPH清除能力很強的抗氧化活性肽，且肽的濃度越高，清除能力越強。Kong等[21]證明利用堿性蛋白酶水解乳清蛋白5小時后得到的水解物FRAP的清除能力最強，并最終證實分子量為0.1～2.8 ku的低分子量肽最具有抗氧化潛力。這些活性肽的具體抗氧化機制還不清楚，但研究顯示肽的抗氧化活性與其分子組成、結構、疏水性和氨基酸的殘基位點有關。今后，我們需要對抗氧化活性肽的構效關系作進一步研究。

表2 酪蛋白胰酶水解物體外抗氧化活性

2.4 酪蛋白胰酶水解物的體內抗氧化活性

機體受到氧化破壞會導致一些老年疾病和神經性器質病變，比如糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥、冠心病等，抗氧化肽可以阻止脂質過氧化物的產生，降低氧化壓力對機體造成的損傷。食品來源的抗氧化肽具有安全、活性強、易吸收、成本低的特點，并且不會引起機體免疫反應風險的優點。

表3，表4和表5顯示了酪蛋白胰酶水解物對小鼠血清、肝、腦組織MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響。結果表明對于小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA含量，模型組相比于正常對照組顯著增加(P＜0.05)。而CTH組小鼠血清、肝和腦組織中的MDA含量顯著低于模型組(P＜0.05)，說明酪蛋白胰酶水解物（CTH）對肝、腦組織和血清脂質過氧化反應有明顯降低的作用，并且，相比于對照組，酪蛋白胰酶水解物（CTH）組的小鼠血清、臟和腦組織中的SOD和GSH-Px活性也顯著升(P＜0.05)。

Martha等[22]發現酪蛋白中性蛋白酶水解物可以影響人體Jurkat T細胞中CAT和GSH的活性。齊微微等[23]利用堿性蛋白酶水解制得的乳清蛋白肽對小鼠進行灌胃實驗，灌胃乳清蛋白肽自然衰老小鼠的SOD和GSH-Px活性顯著增加，MDA和蛋白質羰基濃度顯著降低，同時乙酰膽堿脂酶的活性也有所降低。包怡紅等[24]觀察了乳清蛋白肽對衰老小鼠體內抗氧化能力的影響，發現衰老小鼠血漿、肝臟、腦組織勻漿中CAT、SOD、GSH-Px含量均顯著降低，MDA含量顯著升高，與正常小鼠比較差異顯著，200、400 mg/(kgbw·d)乳清蛋白肽可以提高衰老小鼠血漿、肝臟、腦組織中CAT、SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量，與衰老模型組比較差異有顯著性，乳清蛋白肽能顯著提高亞急性衰老小鼠的抗氧化能力，具有量效關系。今后，我們需要對抗氧化活性肽的構效關系及體內抗氧化機制作進一步研究。

表3 酪蛋白胰酶水解物對小鼠血清、肝、腦組織MDA含量的影響

表4 酪蛋白胰酶水解物對小鼠血清、肝、腦組織SOD活性的影響

表5 酪蛋白胰酶水解物對小鼠血清、肝、腦組織GSH-Px活性的影響

2.5 酪蛋白胰酶水解物的穩定性研究

2.5.1 酪蛋白胰酶水解物的耐消化穩定性

肽類產品的功能性必須考慮其添加在產品中后經消化道后的穩定性。本文通過體外模擬胃腸道消化過程，采取消化酶[E]/[S]=2%，37℃消化4 h來測定CTH的耐消化穩定性。如圖8所示，CTH在胃蛋白酶作用之后，DPPH自由基清除率降低，其原因為部分蛋白肽段因胃蛋白酶的水解作用而被打斷，致使小幅度降低了抗氧化能力。而胰蛋白酶的作用對活性無顯著影響(P＞0.05)，表明消化道酶對產物進行作用后，仍然可以耐受胃腸道蛋白酶作用，以較高的活性參與體內的抗氧化過程。試驗結果較紀銀莉[15]的研究結果相比有所差異，其研究表明水解產物經過胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，清除DPPH的能力會下降，胰蛋白酶處理對水解產物的抗氧化活性影響最大。而劉珊珊等[25]則研究表明酪蛋白抗氧化肽經胃蛋白酶消化后其抗氧化活性顯著下降，在隨后的模擬腸消化中抗氧化活性逐漸回升，甚至完全恢復到消化前的水平。

圖8 酪蛋白胰酶水解物耐消化穩定性

2.5.2 酪蛋白胰酶水解物的耐熱、耐酸堿穩定性

分析CTH對熱、酸、堿等常用加工、生產、儲藏和應用處理方式的耐受性，對確保生物活性及保存期限特別重要。采用在不同p H緩沖液中，沸水浴處理不同時間后比較其DPPH自由基清除率(見表6)。在不同的pH緩沖液中，抗氧化肽的離子狀態會因pH的不同而有所差異，進而對其抗氧化活性造成影響，CTH在p H為5～7時能保持較高的抗氧化活性，在p H為3和pH為9～11時未經熱處理時活性明顯降低，這可能是發生了分解、降解、聚合等反應，導致產物失活。經過熱處理后活性顯著降低，這是因為產物在加熱的過程中會經歷某種程度上的水解，并且抗氧化肽由于高溫而失活。

表6 酪蛋白胰酶水解物的耐熱、耐酸堿穩定（DPPH清除率/%）

2.5.3 酪蛋白胰酶水解物的儲藏穩定性

明確酪蛋白胰酶水解物的儲藏穩定性，確保其在儲存期內的生理功能活性穩定性非常重要。由表7可知，伴隨著儲存時間的持續增加，產物的DPPH自由基清除活性均顯著低于新鮮制備產(P＜0.05)，產物在低溫條件下儲藏相較于常溫具有顯著的穩定性(P＜0.05)。儲藏于-18℃下3個月，活性降低約6%，6個月降低約17%。在4℃下儲藏穩定性相較于冷凍保藏低，6個月后活性降低21%，貯藏穩定性較好。

表7 酪蛋白胰酶水解物的耐儲藏穩定性(DPPH清除率/%)

3 結 論

本文對酪蛋白酶解制備抗氧化肽的工藝進行了優化，并研究了酪蛋白胰酶水解物的抗氧化活性及穩定性。最優酶解條件下，水解度為30.1%，DPPH自由基清除率為68.1%。此酪蛋白胰蛋白酶水解物對羥自由基(·OH)和一氧化氮自由基(NO·)也有著較好的清除效果，并且其對超氧陰離子自由基(O2-·)及亞鐵離子(Fe2+)誘發的卵黃脂蛋白脂質過氧化都具有一定的清除和抑制能力。小鼠實驗表明，酪蛋白胰蛋白酶水解物體現出較好的體內抗氧化作用。穩定性試驗證明酪蛋白酶解產物具有良好的耐消化、耐熱、耐酸堿和耐儲藏穩定性，體現了其作為抗氧化功能原料的良好應用潛力。